第五节　毛细管固相微萃取技术

固相微萃取技术经过十几年的发展，已经十分成熟，特别是与GC的联用，可以使用商品化的自动进样器完成萃取和进样等步骤，但对于液相色谱，却一直没有适用的自动进样设备，只能使用手动进样器与HPLC接口完成直接进样。作为一种样品前处理技术，如果不能实现自动化进样，就很难用于常规分析，因此，Pawliszyn又于1997年首次提出毛细管固相微萃取（in-tube SPME）方法［177］，将涂有固定相的GC毛细管柱用于样品萃取，并与商品化HPLC自动进样器相连，无需使用特殊的接口进行解析，使固相微萃取与液相色谱的联用实现了自动化。同时还克服了纤维SPME的涂层经溶剂浸泡洗脱容易造成溶胀脱落的问题。也有人将此技术称为涂层毛细管微萃取（coated capillary microextraction，CCME）［178］。

由于任何GC开管毛细管柱都可以用于in-tube SPME，也大大拓宽了SPME-HPLC技术的应用范围。目前可供使用的GC毛细管柱多种多样，强极性的固定相种类更远远多于商品化的SPME纤维，使之更适合于强极性化合物的测定。

一、毛细管SPME的装置与操作过程

将一段GC开管毛细管柱安装在HPLC自动进样针和进样管之间，为避免计量泵的污染，进样管应一直置于流路中。毛细管的连接使用的是一小段聚醚醚酮（Polyether Ether Ketone，PEEK）材质的微管，再用一不锈钢箍与流路相连。萃取之前，需用流动相如甲醇等冲洗毛细管，并使流动相停留在毛细管中。萃取开始后，将六通阀扳到“Load”位置，进样针在微机的控制下，反复将样品瓶中的样品吸入、排出毛细管若干次。当样品被吸入毛细管时，分析物就被富集在管壁的固定相中，而当样品被排出毛细管，回到样品瓶中时，流动相又再次进入毛细管，固定相上萃取的分析物就有可能解析下来，因此流动相造成的影响需通过优化试验加以解决。萃取结束后，进样针会从溶剂瓶中吸入流动相或其他溶剂洗脱固定相中富集的分析物，带入后面的进样管（Loop）中，待分析物解吸完全之后，将六通阀搬到“Injection”的位置，使流动相将进样管中的分析物带入液相色谱柱分离测定。整个装置和操作过程如图3-13所示。

应用自动进样器可以使萃取、解吸和进样过程不间断进行，也提高了分析的准确度和精密度，多次测定的相对标准偏差小于6％。当样品中含有分配系数较高的分析物时，所需的平衡时间较长，但样品被反复吸入和排出毛细管，可以起到搅动样品的作用，缩短到达吸附平衡的时间。由于分析物在每次流动相排出毛细管时都会有部分解吸，所以in-tube SPME不能完全萃取样品中的分析物。通常萃取的化合物量取决于涂层的极性、样品被吸入排出毛细管的次数和体积，以及样品的pH值。

毛细管内的涂层选择与纤维SPME方法相同，也遵循“相似相溶”的原则，针对极性的化合物，应选择极性的涂层。用于萃取的毛细管长度在50～60cm范围内是最好的。毛细管太短，萃取效率较低，毛细管太长，萃取的分析物在解析时过于分散，就会出现峰展宽的现象。样品总的吸排体积可以用进样针和毛细管的总体积来计算，增加吸排的次数和体积也能提高萃取效率，但经常使色谱峰展宽。样品吸排的流速会同时影响萃取率和方法的精密度，即较高的吸排速度一方面可以良好地搅动样品，使分析物的质量传递加快，增加萃取效率；另一方面，又会使流动相中产生气泡，降低萃取的效率和精密度。因此最优的吸排流速范围是50～100μL·min-1。低于此流速范围，萃取时间较长，不利于快速分析的进行。

平衡时间对in-tube SPME也十分重要。不同于纤维SPME，其萃取时间的优化需要通过萃取量对吸排样品的次数作优化曲线来进行选择。而其他的萃取条件如样品的pH值、盐度等，调节方式则与纤维SPME方法相同。

进样的体积就是完全解吸分析物所需的流动相体积。Gou等用60cm长的毛细管萃取分析物，之后再用不同体积的流动相洗脱，根据得到的色谱峰分析，发现洗脱曲线并非线性的。开始的20μL流动相使62％的分析物解吸，接下来的20μL又解吸了24％的分析物，若使分析物达到100％解吸共需要60μL的流动相［179］。

比较in-tube SPME方法与纤维SPME法，二者各有各的优缺点，但最大的差别就在于萃取的化合物一个是富集在纤维的表面，另一个是富集在毛细管的内壁。in-tube SPME使用细径毛细管，为防止柱和流路的堵塞，必须在萃取前去除样品中的颗粒物，因此in-tube SPME适合洁净水样的分析。而纤维SPME不用去除样品中的颗粒物，因为可以用顶空萃取消除干扰，或在直接萃取后用水冲洗纤维清除其上的颗粒物，但纤维易于折断，还会在进样和搅动中遭到破坏。in-tube SPME和纤维SPME均可与HPLC联用，但二者的进样方式也存在差别。纤维SPME中，要将纤维暴露在进样接口中，用流动相或其他溶剂冲洗纤维，待分析物完全解吸后，再进入色谱柱分离。由于某些分析物从纤维上洗脱速度较慢，常常造成色谱峰展宽的现象。而in-tube SPME中，用流动相或其他解吸溶剂通过毛细管柱，直接解吸并使分析物进入分离柱，实现了解吸、进样的一体化，峰展宽的现象得以缓解。

二、毛细管SPME原理的数学模型

毛细管SPME萃取有两种基本方式：①动态法——在样品反复通过毛细管时萃取分析物；正如上文所描述的；②静态法——即样品处于静止状态，分析物通过扩散的方式迁移到毛细管固定相中，多应用于现场采样。

1.动态毛细管SPME萃取

毛细管SPME应用毛细管柱萃取化合物，是一个动态的吸附-解吸过程。其理论与液相色谱理论相似。若以k表示样品在毛细管中的分配比，则：

　　 （3-10） 　　

式中，Kfs是涂层与样品之间的分配系数；Vf是毛细管萃取相的体积；Vv是萃取用毛细管的死体积；ds是固定相涂层厚度；dc是毛细管的管径。

毛细管柱的理论塔板高度（以H表示）与萃取系统的几何形状有关，可由开管毛细管系统的Golay公式推导，得到下式，即

　　 （3-11） 　　

式中，u是溶剂在毛细管中的线性流速；Dm是溶质在流动相中的扩散系数；Ds是溶质在固定相中的扩散系数。上式中的最后一部分说明了溶质在固定相中的缓慢平衡过程，当用开管毛细管萃取水样中的化合物时，可以忽略不计，于是上式可以简化为下式：

　　 （3-12） 　　

当毛细管萃取样品时，萃取相中分析物的浓度与其在管中的分配比和理论塔板高度都有关系，在整个富集过程中，任何时刻，萃取相中分析物的轴向浓度都是时间t的函数。扩散的平均方根可用σ表示

　　 （3-13） 　　

在引进样品时，分析物迁移的前锋通过毛细管的速度与样品的线性流速成正比，与分配比成反比［180，181］。由于毛细管SPME萃取用毛细管都很短，样品分散程度小，所以认为萃取所需的时间与样品到达毛细管末端的时间相似，可用下面两式表示：

　　 （3-14） 　　

　　 （3-15） 　　

式中，L是毛细管中固定相的涂层长度。从上式可以看到，萃取时间与毛细管长度成正比，与样品的线性流速成反比，而且随着涂层-样品分配系数的增加而增加。萃取时间还与萃取相的体积以及柱的死体积有关，毛细管长度不同，其死体积和固定相体积都会不同。一般死体积大，会使萃取时间减少；固定相体积增加，虽然可以萃取更多的化合物，但所需的平衡时间也延长了。增加涂层-样品间分配常数可以增加萃取的绝对数量。已经发现在多数情况下用甲醇或其他一些适当的溶剂，在萃取前预载毛细管，可以增加萃取的数量。因为在样品吸入毛细管进行分配的阶段，样品一直跟随由甲醇形成的溶剂带，这与SPE中用来加强萃取效果的预载溶剂作用相似。

应该指出式（3-15）仅对直接萃取有效。如果样品在管内的流速非常快，涂层-样品间的分配系数又不是很高，那么样品流动就可以达到一种良好的搅动状态，此时的平衡时间可用式（3-16）表示：

　　 （3-16） 　　

用上式可以根据分析物在固定相中的扩散系数（Ds）和涂层的厚度（ds）估算实际体系能达到的最短平衡时间。

2.静态毛细管SPME快速采样

现场采样时，必须考虑样品浓度随时间推移而发生的变化。使用内壁涂有固定相的毛细管采集样品，样品静止在管内进行静态萃取。当把毛细管带离采样地时，两端具有保护的管结构对随时间和地点变化而变化的分析物总浓度产生成比例的响应［182］。此时，分析物迁移到萃取相只是通过扩散作用。在这一过程中，管内建立起一个线性的浓度梯度。随时间的增加，固定相萃取的化合物量（n）可用下式计算：

　　 （3-17） 　　

式中，A为管的截面积；Z为管进样口与萃取相所在位置间的距离；c（t）为样品接近管开口处的分析物的浓度，与时间相关；Dg为分析物在气相中的扩散系数。

萃取分析物的数量与样品浓度和分析物的扩散系数成正比，而与涂层相对于管开口处的位置成反比。要强调的是式（3-17）仅在固定相萃取样品中很少量的分析物的情况下成立。

三、毛细管SPME的应用

毛细管SPME与HPLC联用在强极性化合物和热不稳定性化合物的测定方面显示出极大的优越性。Pawliszyn小组将其用于环境样品中氨基甲酸盐杀虫剂的测定［183，184］，由于使用梯度洗脱法，所以在进样量加大的情况下，不会造成峰形变宽。六种氨基甲酸盐可达到基线分离，最低检出限为0.3μg·L-1，萃取率达到15％～34％。用少量甲醇（4μL）预载萃取毛细管，可以成倍提高萃取效率。

苯基脲类除草剂也是一类强极性化合物，用毛细管SPME-HPLC能够定量萃取和测定，线性范围可达到3个数量级，线性相关系数大于0.99。每次测定后用250μL甲醇冲洗，毛细管中就不会有残留影响下一次测定。研究人员还发现，在分析系统中使用细径的HPLC柱，可以改善峰形，提高灵敏度［177］。Hartmann用类似的方法分离测定了11种除草剂，整个分析时间只需11min。不同的样品基体如溪流、河水、污水等对分析没有影响，而且毛细管表现出良好的稳定性，每根毛细管可重复萃取样品100次以上［178］。

应用毛细管SPME技术可以进行药物检测［185］。β-阻断药能够刺激中枢神经系统，具有类交感神经的特点，是国际奥林匹克委员会和国际体育联盟禁止使用的一类兴奋剂，因此它的检测在临床、法医学和毒理学等许多方面都很重要。应用毛细管SPME自动化进样系统，与液相色谱-电喷雾离子化质谱联用完成定量测定，为兴奋剂的常规快速灵敏检测提供了美好的前景。用极性涂层的毛细管萃取、分离血清和尿样中的9种β-阻断药，由于样品基体的复杂程度不同，所以血样的回收率范围为71％～112％，尿样的回收率范围在84％～113％之间［186］，从上述结果可见，方法的准确性可以得到保证，而且血、尿等生物样品也无需复杂的处理，只要经过水或缓冲溶液的稀释和过滤处理即可，十分简便。

有机金属化合物也可尝试用该技术测定。以涂有多孔的二乙烯基苯聚合固定相的Supel-Q Plot GC毛细管柱直接萃取三甲基铅、三乙基铅［187］的氯化物，无需衍生反应，即可使两种烷基铅化合物得以形态分离，并用电喷雾质谱（ESMS）检测器测定，得到这两种铅化合物的质谱图。对环境中的三丁基锡［188］化合物，毛细管SPME富集后以质谱测定，方法检出限为0.05ng·mL-1。

Saito等将毛细管SPME技术与纤维SPME技术结合起来，建立了管内纤维SPME技术（Fiber in-tube SPME）［189］。他们将280根直径为11.5μm的带杂环的聚合物——赛璐珞刚性纤维插入0.25mm的PEEK细管中，作为萃取的介质，与HPLC-UV联用富集分离废水中的内分泌干扰物邻苯二甲酸盐（或酯），取得了很好的结果。相对于开管式毛细管SPME技术，管内插入的纤维，具有很强的富集能力，同时极大地增加了样品与萃取相接触的面积，萃取率可达到50％，而多次测定的相对标准偏差小于1％。

还有人尝试将毛细管SPME与GC联用测定水样中的酚和多环芳烃［190］。分析物经毛细管富集后，解吸方式可以是热解吸，即将萃取毛细管中的样品吹出、吹干，通过石英压封接头将富集柱与分析柱相连，再整个置于GC柱箱内加热解吸。也可以是溶剂解吸，即样品富集后吹干毛细管，再注入适当的有机溶剂（约100μL），待分析物解吸以后，采用柱内进样方式用辅助载气将溶剂以一定的流速引入GC。由于进样体积较大，还要使用保留间隙柱。此联用方式没有自动进样装置可用，不适于日常工作，较纤维SPME而言，还增加了操作步骤，灵敏度也比较低。利用增加富集柱的长度来提高萃取灵敏度，在进样时无论采用哪种方式，都容易造成色谱峰的拖尾现象，不利于化合物的形态分析。