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第四节 酶联免疫分析
一、原理
酶联免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）的原理与RIA和IRMA相同，其不同之点是用酶替代放射性核素标记抗原或抗体，经竞争性或非竞争性免疫结合反应，产生的免疫复合物，其中的酶可催化特定底物，生成有色产物，再根据有色产物的吸光度不同来对受检样品作定性或定量分析。
1.常用的酶标记物
（1）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：
用于EIA的主要是HRP的C型同工酶。HRP首先与H 2O 2结合形成活泼的“氧化剂”，再催化底物氧化生成显色产物。HRP的常用底物有：邻苯二胺（OPD）、5-氨基水杨酸（5-ASA）、四甲基联苯胺及其硫酸盐（TMB、TMBS）、邻联甲苯胺（OT）等。
（2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）：
AP系水解酶，将不同的磷酸酯水解使之成为有色产物。常用底物为对硝基酚磷酸酯（p-NPP）、酚酞单磷酸酯（phenolphthelein monophosphate）。
有以下各类EIA：
2.按免疫反应后，是否分离结合抗原（B）和游离抗原（F）可分成：
（1）均相EIA：
又称酶检测免疫分析技术（enzyme monitored immunoassay technique，EMIA）。酶与半抗原结合为酶标半抗原，与被测半抗原竞争地与抗体结合，标记抗原与抗体结合后，酶的活性即被抑制，因此不需加入分离剂，直接测定游离酶标半抗原的酶活性即可推算被测半抗原的量。EMIA主要用于小分子抗原或半抗原的定量如激素、药物或毒品等的分析。
（2）异相EIA：
酶标抗原或抗体与标本中的待检抗体或抗原结合，分离除去未结合酶标抗原或抗体后，加入酶底物显色即可作定性或定量分析。常用固相分离法，又称为酶联免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），与均相EIA相比，该法应用范围较广，可标记各种抗原和抗体。
3.根据所用固相物质不同又可分为：
（1）板式ELISA：
全部反应和比色都在塑料微孔板中进行。目前国际通用8×12的96孔板。
（2）管式ELISA：
用小管作为反应容器和比色管，反应体积大，比色光径长，可在一定程度上提高检测灵敏度。
（3）小珠一般直径为6mm，吸附面积明显增大。
4.按抗原抗体结合方式可分成：
（1）竞争性结合酶免疫法标记抗原与待测抗原竞争地与抗体相结合。
（2）非竞争性结合酶免疫法抗原抗体之间的反应不存在竞争性。
1）直接ELISA：酶标记抗体与待测抗原非竞争性结合，再与固相载体形成复合物，称双抗体夹心法，常用于测定较大分子抗原。
2）间接ELISA：酶标记的第二抗体作为一种通用试剂，可与任何第一抗体结合。
现以应用最为广泛的ELISA为例加以说明。
二、试剂组成
1.酶标抗体（抗原）要求酶稳定不失活，4℃可保存数月。
2.固相抗体（抗原）聚苯乙烯微孔条，透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小。包被抗原纯度高，包被抗体效价高，亲和力强，4℃、密封、避光、干燥的环境中保存，一般可保存6个月。
3.底物底物应稳定，易于保存。OPD为白色粉末，易于氧化并对光敏感，应密封保存于棕色瓶内，4℃干燥环境下存放，临用前配制。而TMB配制后密封保存在棕色瓶内，4℃可存放半年。
4.结合物和标本的稀释液中常加入高浓度的无干扰作用的蛋白质（如10g/L BSA或50g/L脱脂奶粉），一般还含有0.05%非离子表面活性剂如Tween 20，可抑制蛋白质在塑料表面的非特异性吸附。
5.洗涤液常用含0.05% Tween 20的PBS。
6.酶反应终止液常用2mol/L硫酸。
三、检测条件和方法
1.仪器设备专用微量加样器、加样头、平板振荡器、水浴箱或孵箱、洗板机、酶标仪。全自动酶联免疫分析系统，可精确控制反应条件，结果更为可靠。
2.检测方法以CanAg公司检测试剂盒为例，其免疫反应原理为生物素-链霉亲和素参与的双抗体夹心法（生物素-链霉亲和素系统原理参见电化学发光部分），具体检测程序如下：
（1）将25μl样品或标准品按顺序加入链霉亲和素包被的微孔条中。
（2）每孔加入100μl单抗工作液（含HRP标记抗单抗和生物素标记抗单抗），形成生物素-抗体-抗原-抗体-HRP免疫复合物，并通过生物素-链霉亲和素的特异性结合固定于微孔内壁。
（3）室温孵育1小时。
（4）洗涤微孔条并在滤纸上拍打除去残留洗涤液，重复6次，以去除游离的或抗体。
（5）加底物应用液（包含TMB和H 2O 2）。震荡反应30分钟。
（6）加终止液，混匀后在酶标仪上读取OD值，按要求作数据处理，得出结果。
四、注意事项
1.HRP对金属污染物很敏感（甚至不能使用金属的加样器），因此对试剂和试验用水的要求较高，应用新鲜的蒸馏水或去离子水。但通过聚苯乙烯树脂得到的无离子水常影响HRP活力，如果不使用Tween 20，作固相载体用的聚苯乙烯板也可影响HRP活力。另外，HRP对细菌及抑菌剂如NaN 3特别敏感，因此用NaN 3防腐的标本不可用于HRP标记的一步法ELISA；试验用水中的氧、次氯酸、芳香族的氯碳化合物都会影响HRP的活力。此外应注意H 2O 2不仅是HRP的底物，也是HRP的抑制剂，过量的H 2O 2对固相HRP的抑制作用比游离HRP更明显，因此HRP的浓度应维持在0.01%～0.03%之间。同时，H 2O 2易挥发，放置过久引起浓度降低，可使OD值降低。
2.OPD可能有致癌作用，故目前倾向用TMB代替OPD。
3.AP有两种来源牛的肠黏膜和大肠杆菌，二者的最佳酶活度的pH不同，前者为pH 10，后者为pH 8。无机磷酸盐是AP的强抑制剂，因此试验中应避免使用PBS液；金属络合剂如EDTA也是AP的强抑制剂，应注意避免。
4.孵育最好在水浴中进行，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡，各板不可重叠，板上应加盖防止蒸发。如在孵育箱中反应，应将板置于湿盒中。