第二节 肿瘤干细胞与上皮—间质转化
一、上皮间质转化的概念
上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transitions，EMT）是指上皮细胞通过特定的程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。上皮间质转化是一种进化保留的发展过程，有利于组织发生和器官形成。通常认为，上皮细胞具有分泌功能，其顶端和基底具有极性，他们之间通过细胞黏附和紧密连接在细胞和细胞之间以及细胞和基底膜之间相互联系。间质细胞则提供支架或锚定功能，在组织修复和创伤愈合中有重要作用。EMT允许极化的上皮细胞，通过基底面同基底膜相互作用，经历多种生物学转化，最终形成具有间质细胞表型的细胞，这个过程包括迁徙能力、侵袭力的提高，对细胞凋亡抵抗的增强和细胞外基质（ECM）产生的增多。这个过程的典型特点是细胞和细胞之间连接的溶解，以及尖端和基底端极性的消失，并最终成为具有侵袭性的间质干细胞表型和功能的细胞。这些间质细胞被招募到生长中的胚胎中后可以再分化为上皮组织。完成EMT的标志是基底膜的退化和形成的间质细胞可以从其起源的上皮层迁徙。
在正常的胚胎发生过程中，EMT可以导致细胞和细胞之间连接的消失，细胞固有运动性的增强，促进细胞的广泛转移，最终在原胚肠形成和器官发生中发挥重要的作用。并且，在正常的成人组织中，EMT程序处于静止状态，并将在损伤修复和组织再生时被再激活，从而在损伤修复的组织再生中发挥重要作用。然而，EMT调节异常可能导致病理情况，例如器官纤维化和组织破坏。
一系列的分子过程参与启动EMT和使其能够达到完全状态。这其中包括了转录因子的激活，特殊细胞表面蛋白的表达，细胞支架蛋白类的改组和表达，以及生产ECM降解酶和特殊的microRNA表达的改变。
二、EMT的基本特点和调节机制
EMT的一个重要特点是失去E-cadherin的表达，E-cadherin是细胞与细胞之间黏附必需的关键分子，作为细胞表型的看管者，E-cadherin 有助于集合表皮细胞层和维持这些层内细胞的静止。Snail 是最早发现也是最重要的E-cadherin 转录抑制因子受体。它最早在果蝇体内控制胚胎发生的 shotgun（E-cadherin同系物）转录受体的研究中被发现，随之发现其在哺乳类动物细胞的EMT中发挥基本作用。除了抑制E-cadherin的作用，Snail还发挥下调如Claudins、Occludins和Muc1等其他表皮分子的作用，而且可以诱导与间质细胞性和侵袭性表型相关联的基因的表达。
ZEB为E-cadherin的转录抑制物，ZEB家族成员在EMT激活物中与miR-200家族相互作用。miR-200家族可以抑制ZEB1和ZEB2表达，因此维持CDH1表达和上皮表型。为了证明miRNAs的作用，在TGF-β诱导的EMT小鼠模型中，正常鼠科哺乳动物的上皮细胞可以被诱导发生EMT，所产生细胞有更多的间质表型，并引起CDH1（N-cadherin）下调和CDH2（P-cadherin）上调，过度表达miR-200家族中的每一个miRNA（miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c 、miRNA-141及 miRNA-429）可以抑制这个模型中的 EMT，维持 CDH1高水平表达，据报道，这些miRNA直接抑制ZEB1和ZEB2。进一步的研究显示，ZEB1可以抑制miR-200表达，由此认为在调节EMT过程中存在ZEB1/miR-200反馈回路。最近的研究证实，在乳腺正常细胞和乳腺肿瘤干细胞低水平的miR-200家族的miRNA，负调节转录因子 Zeb1 和 Zeb2，促进 EMT（图 4-12）。
三、EMT的分型
在体内存在着不同类型的EMT，他们发生在不同的生物过程中，通常情况下，我们将EMT分为以下三种类型（图4-13）。
第一种类型的EMT与移植、胚胎形成、器官发生有关。这种类型的EMT可以产生初级间质细胞，并通过间质上皮转化（MET）的过程产生次级上皮细胞，实现胚胎形成过程中的细胞类型多样化，是胚胎形成过程中的重要过程。
第二种类型的EMT与创伤修复、组织再生和器官纤维化有关。这种类型的EMT发生在组织损伤修复和炎症反应过程中。在与炎症相关的EMT中，一旦炎症减弱即应立即停止。在持续的炎症中不间断的EMT过程最终导致组织纤维化和器官损伤，异常的第二种类型的EMT是慢性炎症导致组织纤维化的重要机制。
第三种类型的EMT发生于预先经历了基因和表观遗传改变的赘生细胞，特别是在基因使局部肿瘤无性系过生长和发展过程中。这些改变，显著地影响致癌基因和抑癌基因，并同EMT调节环路（circuitry）一起产生与前两种类型完全不同的EMT。肿瘤细胞经历第三种类型的EMT后可能发生转移，从而形成有生命危险的临床表现和肿瘤进展。重要的是，肿瘤细胞可能经历EMT程度不同，即一些细胞在获得一些间质细胞功能的同时保留许多上皮细胞特性，而另一些细胞则失去了所有上皮细胞痕迹而成为完全的间质细胞。但是，尚不清楚在肿瘤细胞中，第三种EMT是由何种信号诱导。
这三种类型的EMT出现在不同的生物过程中，但是相同的遗传和生物化学基础揭示了这三种EMT之间具有一定的共性和内在联系。正是这种相似的基因控制和生化机制使肿瘤细胞在播散中存在夺取机体原本用于正常生长发育的信号通路用于转移播散的潜能。
四、EMT和肿瘤的关系
EMT在肿瘤的转移过程和治疗的耐药性中起重要作用，一个器官上皮细胞获得EMT是肿瘤发生过程中的重要步骤。
EMT是肿瘤侵袭机制中重要和早期的步骤，并且和很多肿瘤预后较差有关。对于一个成功的肿瘤转移，必须经过多个步骤，这包括肿瘤细胞从原发灶脱落，侵入周围组织，进入血液循环系统，在血液中逃避免疫监视而存活，外渗出血管进入靶器官组织，最终在靶器官组织种植（图4-14）。肿瘤上皮细胞经历EMT之后失去了细胞和细胞之间的黏附性能和极性，并且获得了更多的间质细胞样的表型，包括运动、侵袭和对细胞凋亡抵抗的增强。从而使肿瘤细胞更容易从原发部位迁徙到身体其他部位。同时，肿瘤细胞经过EMT后获得肿瘤干细胞样的功能，即自我更新能力和肿瘤功能增强。因此，EMT使浸润的肿瘤细胞自我更新性能增强，提高了他们在远处种植和生长的机会。基于这两点，我们认为EMT与肿瘤转移之间存在一定联系，EMT在肿瘤过程中最终会导致细胞获得侵袭和转移的能力。
最近，通过对EMT的一系列研究发现了其与干细胞表型标记之间的联系。
在乳腺肿瘤中，通过评估在活体组织中特定表型的乳腺细胞亚群重新入住的活力，以及是否具有已被公认的人和小鼠的乳腺干细胞或祖细胞的特点，可以初步识别部分干细胞相关标志。
在小鼠体内，一个有着Lin-/CD24+/CD29high表型的单个细胞可以重新组成具有完整功能的乳腺。有趣的是，这些被称作乳腺重新入住单位的细胞，表达细胞角蛋白5和14、平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和平滑肌肌球蛋白，标记表型同基部/肌上皮细胞有关联，显示了其与上皮细胞之间的联系。
在乳腺癌中CD44+/CD24-/low表型的细胞被定义为乳腺癌细胞中的具有干细胞特征的一系列细胞亚群，换句话说，就是具有自我更新能力和有能力重新组成已分化的肿瘤的细胞。在有限稀释的实验中，仅仅100个CD44+/CD24-/low细胞注入非肥胖型的糖尿病小鼠/严重免疫缺陷的小鼠就有能力形成肿瘤，然而好几万的替代表型（alternate phenotypes）的细胞注入这种小鼠却不能形成肿瘤。这表明了CD44+/CD24-/low细胞具有干细胞特性。最近，乙醛脱氢酶（ALDH-1）的表达已经作为鉴别正常和恶性的乳腺干细胞的另一个标志。
研究已经证实EMT和细胞表面表达CD44+/CD24-/low表型相关。甚至，游离于肿瘤组织的大部分肿瘤细胞，都联合表达一个或更多的EMT标记和ALDH-1，这些细胞很可能由EMT产生，暗示了ALDH-1 和CD44+/CD24-/low表达可能可以被用来确定EMT相关的乳腺肿瘤干细胞中有较强干性的细胞亚群。然而，到目前为止没有一个标记可以用来彻底区分乳腺干细胞和肿瘤干细胞。
毫无疑问的是，我们对这个领域需要给予更多的关注和努力，而且它很可能成为潜在的治疗位点。尽管如此，不容忽视的是，肿瘤干细胞表型与EMT之间的关系暗示了EMT与肿瘤干细胞之间的联系。
最新的研究表明，肿瘤干细胞的形成在某种程度上是EMT的结果。一个器官上皮细胞进行EMT可能是肿瘤发生过程中的开始步骤。在病理条件下，例如组织损伤或是肿瘤发生的过程中，通过EMT可以引起已分化细胞获得多能干细胞样表型细胞的能力。这可能反映了调节发育的EMT信号转导通路，例如Wnt、Notch和Hedgehog等通路，可以驱动正常干细胞和肿瘤干细胞的更新和维持。研究还表明，已经经历了EMT的转移癌细胞，可能存在肿瘤干细胞的表型。例如，在胸腔积液中的浸润乳腺癌细胞有丰富的CD44+/CD-/lowCSC肿瘤干细胞样细胞群，CD44是β-catenin/TCF-4的靶基因，它支持EMT相关的Wnt信号通路在干细胞维护中的作用。
Weinberg 及其同事最近报道了EMT和干细胞出现相关联的实验证据。已分化的经历了EMT的乳腺上皮细胞，不管是在TGFβ治疗中或是通过强迫表达E-cadherin转录抑制因子，例如Snail，都会形成CD44+/CD-/lowCSC细胞，即近似乳腺肿瘤干细胞。用一个体外的研究方法，Mani及其同事报道了通过异常的Twist或snail转录因子的表达引诱永生化人乳腺上皮细胞（HMLERs）EMT。Twist或Snail的过度表达让HMLERs在自然环境下更加间质化，同时形成微球体（mammosphere）的能力增强和CD44+/CD-/lowCSC标志的表达的增加。这些数据支持经过EMT的细胞失去表皮性能和获得CSC样性能之间的直接联系，这个团队更深入的研究显示FOX2可能在体外引诱EMT过程中发挥关键作用，这些通过肿瘤发生信号确定，因此暗示FOXC2可能在EMT发展和CSCs自我更新中发挥作用。最近的研究认为在这个过程中，主要驱动力为TGF-β信号通路，特别是在通过控制CSCs状态，驱使肿瘤从局限于原发部位到转移的转变过程中。活化β-catenin和通过Twist活化Akt通路是维持EMT相关的CSC样状态的重要因素，并猜测ZEB/miR-200 反馈通路是在分子水平上EMT与CSC联系。总之，引人注目的证据存在于EMT和肿瘤干细胞样的表型的联系，可能是肿瘤细胞转移的先决条件。
Brabletz和同事补充和完善了EMT和CSC的整体观念，他提出了CSC的两个部分固定的CSC和迁徙的CSC（MCSC）。这些假设基本条件固定的CSC控制干细胞特性，像是不对称增殖和耐药性，但是不能够迁徙，为了传播和转移，肿瘤细胞必须刺激使EMT活化的程序，从而向MCSC表型来转化。这个转化可能通过肿瘤微环境来引诱，通过分泌EMT-诱导生长因子和细胞外基质，MSCS随之可以进入血液循环，散布，渗出，最后在靶器官种植形成转移。这些同样可以解释在远端的MET，因为在与原发肿瘤部位不同的远端组织的微环境可能不分泌EMT刺激信号，在不存在这些信号的地方，MCSC可能经历MET的过程。
虽然大量证据表明EMT能促进肿瘤干细胞表型的生成，但认清这个过程是如何起到控制和调节的作用具有重要意义。一系列的信号可以导致EMT被肿瘤微环境接受，例如缺氧。Heddleston及其同事发现缺氧促进自我更新功能和干细胞表型在非干细胞的群体中出现，并增强了他们的神经球生长功能和重要的上游调节干细胞因子，像Oct4、Nanog和 c-Myc。并且，在非干细胞种群中表达增强了肿瘤潜在的发生可能。需要注意的是，除了调节细胞可塑性，缺氧和其他的来自微环境的EMT增长信号因子，例如TGB-β，同样可以刺激增殖和扩展先前已经存在的肿瘤干细胞池，因此增加了肿瘤侵袭的机会。在EMT中，信号传导通路发挥了重要作用。通常认为，在EMT中以下几种信号发挥了重要作用（图4-15）。
Notch受体和他们的配体在增殖、分化、胚胎发生和细胞凋亡中发挥作用。Notch 由非共价的受约束的细胞外结构、跨膜部分和细胞内的部分组成。
尽管与细胞类型和环境相关，Notch信号可以通过激活NF-kB或TGF-β信号来使EMT开始。并在进化中保留了通过与NICD相互作用来调节Notch活动的Numb，它将导致NICD聚泛素化和降解。研究表明Numb介导的Notch抑制可以破坏近50%的乳腺肿瘤，导致Numb的降解。并且，在乳腺癌患者中已经观察到Notch信号的过度表达和较短的生存期之间的关系。这些都表明了Notch信号在EMT和肿瘤进展中的重要作用。
TGF-β信号同样在EMT、胚胎形成和癌症发病中的过程中发挥了重要的作用。其中关键的分子是TGF-β诱导转录因子Snail、Twist、Six family homeobox（Six1）和ZEB（ZEB1 和 ZEB2/SIP）。
在乳腺癌干细胞中，TGF-β似乎起着调节干细胞表型和维持其多能性的作用。TGF-β可以改变乳腺上皮细胞紧密连接结构和在一系列胚胎的信号通路中诱导信号产生，这些信号通路包括Wnt、Notch和Hh通路。在EMT中，Snail1及Snail2/Slug（Snail）同Smad3和Smad相关联，在TGF-β信号通路中通过抑制或制止E-cadherin、occludin 及 claudin的转导来引诱肿瘤的生长和转移。另外，一些研究表明在转移性乳腺癌干细胞中强有力的表达该通路信号，而且在通路被抑制后变得更加像上皮细胞，暗示TGF-β在驱使乳腺癌EMT和促进CSC维护中的重要作用。
Hh配体Sonic、Desert 和 Indian，通过定义极性，形态发生，增殖和分化来调解胚胎形成。Hh信号调节组织极性，负责维持干细胞。Hh配体绑定在12跨膜蛋白上，Patched（PTCH）结合将导致对Smoothened（SMO）的去抑制。然后SMO改变初级纤毛的位置，随之它内在化和被激活。最终信号激活锌指转录因子Gli-1、Gli-2和Gli-3，导致Gli靶基因转录。Gli-1和Gli-2的激活物和Gli-2、Gli-3的抑制物之间的平衡形成适度的Hh信号。
EMT和转移被来自胰腺癌细胞系的SMO抑制因子封堵，例如，cyclopamine是一个SMO拮抗物，减少细胞的运动和生长。Hh信号通过诱导E-cadherin、Snail1抑制剂的表达在EMT过程中起关键作用。高水平的Gli1在结直肠异种移植物中表现较高的转移潜能，上皮形态和EMT相关的标志物。
Wnt信号通路控制了胚胎发生和生长过程中的一些生理变化，例如乳腺发育和怀孕及哺乳期间的乳房分化。在非活动状态下，细胞质的β-catein通过细胞由腺瘤性结肠息肉病（APC）、糖原合成酶激酶 3β（GSK3β）、Axin及casein kinase-1α，组成的毁坏复合体而减少。在Wnt信号中，活化的毁坏复合物是抑制的，允许β-catenin积累和迁移至核心，在那里，同淋巴增强因子（lymphoid enhancer factor）/T细胞因子（T cell factor）复合体（Lef/Tcf）相互作用导致靶基因转录。
Wnt信号可以被归纳为 canonical/β-catenin 或 non-canonical。canonical/β-catenin 信号绑定到Fzd Wnt，导致细胞核内β-catenin积累。β-catenin在细胞核或细胞质中积累已经被报道在大约50%的乳房癌中出现并和不良预后相关。non-canonical Wnt信号不会导致β-catenin在细胞核积累。在Wnt/β-cantenin通路中，下游的Axin2基因与糖原合成激酶3β形成复合物，使锌指转录因子Snail稳定表达，进而诱导乳腺癌细胞EMT形成。
（马 望 邵明琛）