第二节　肿瘤干细胞与免疫微环境

目前对于肿瘤干细胞的研究思路与假设，很大程度是借鉴正常干细胞和普通肿瘤细胞的研究成果。肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞类似，可以与免疫微环境中的多种组成部分相互作用。而且，往往肿瘤干细胞有着更强的效应。以下将从正反两方面对肿瘤干细胞与免疫微环境进行介绍。

调节性T细胞是一类特殊的T细胞，具有独特的免疫学功能。其主要功能为抑制自身免疫和过敏反应，限制炎性反应的强度和持续时间，并且与其他一系列的细胞（如T细胞、树突状细胞等）和分子（如TGF-β、IL-10等）有着密切的关系。

这类细胞最早被发现始于20世纪70年代，当时被命名为抑制性T细胞。在1995年，作为该领域的一个重要里程碑，Sakaguchi等人发现一种CD4阳性调节性T细胞的共表达分子——CD25。从此，对于调节性T细胞表型、功能、机制等的研究开始逐步深入。

目前，对于调节性T细胞的表型仍然存在争议，并不断有新的调节性T细胞被发现。根据表型、所分泌细胞因子和免疫抑制机制的不同，调节性T细胞亚型主要包括CD4⁺FoxP3⁺调节性T细胞、Tr1、Th3、调节性T细胞样细胞、CD8阳性T细胞等。不同于CD4⁺FoxP3⁺调节性T细胞，Tr1、Th3、调节性T细胞样细胞和CD8阳性T细胞具有表型或者免疫机制的独特性。但是，目前有关调节性T细胞的研究主要是集中于CD4⁺FoxP3⁺调节性T细胞，其主要分为两类，即在胸腺产生的天然的调节性T细胞（nTreg）和在外周诱导产生的诱导型调节性T细胞（iTreg）。人类的这两种调节性T细胞的表型，功能机制等差异很小。因此，尽管目前前沿的研究有个例报道发现两种细胞的独特表型，但是实际上，目前没有确切的分子标志有足够的特异度和灵敏度能够区分两者。

对于调节性T细胞的分子表型标志，多年以来争议不断。而且近年来新的表型也不断被提出。目前得到公认和广泛应用的表型包括CD25、CD127、FoxP3等。FoxP3主要在胞内表达，因此在许多要求必须保证细胞膜完整的实验或者活细胞实验中，CD127可以作为FoxP3的替代。FoxP3是调节性T细胞分化和功能的重要分子，也被认为是调节性T细胞最为重要和确切的分子标志。该分子的缺失或功能缺乏可以导致致死性的IPEX综合征（免疫失调、多发内分泌腺病、肠病、X染色体性联遗传症候群），引发严重的自身免疫反应，包括湿疹、肠炎等。

研究发现肿瘤干细胞可以通过一系列直接和间接的方式影响调节性T细胞，从而改变肿瘤免疫微环境。由于调节性T细胞是一群重要的免疫抑制细胞，因此来自肿瘤干细胞的这一调控，对于肿瘤发生发展机制的进一步深入研究和寻找打破肿瘤免疫耐受的方法具有重要意义。而目前针对调节性T细胞对肿瘤干细胞作用的研究较少，少部分研究发现了直接的调控机制，大部分研究还只是停留在间接的调控上。下面本章介绍当前比较明确的肿瘤干细胞与调节性T细胞之间的相互作用现象和机制。

肿瘤干细胞可促进调节性T细胞的生成和功能的激活。肿瘤干细胞与非干细胞相比通常具有更强的诱导免疫耐受作用。其中，调节性T细胞作为免疫耐受的重要细胞之一直接或间接被肿瘤干细胞所调控，从而诱导调节性T细胞生成，免疫耐受相关因子分泌增加，免疫抑制功能增强。以下将主要介绍肿瘤干细胞通过B7.2或B7-H1的途径对于调节性T细胞进行直接调控。

目前，在对恶性黑色素瘤的研究中发现肿瘤干细胞依赖B7.2的通路直接诱导CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺的调节性T细胞的生成，同时上调IL-10的水平。在恶性胶质瘤中同样证实肿瘤干细胞可以通过分泌TGF-β和依赖B7-H1的直接接触机制诱导有明显抑制功能的CD4⁺FoxP3⁺调节性T细胞产生。因此，肿瘤干细胞可通过调控肿瘤免疫耐受网络中发挥关键作用的调节性T细胞，促进肿瘤的发生发展。

调节性T细胞可促进肿瘤干细胞的形成，功能维持与激活。目前对于调节性T细胞调控肿瘤干细胞的研究较少。大部分研究主要停留在一些间接的调控机制上，即调节性T细胞作用于一些在调控网络中处于上游的分子或细胞，从而调控位于下游的肿瘤干细胞。例如，调节性T细胞可以参与到巨噬细胞、TGF-β，以及上皮间质转化的调控网络中，而这些因素与肿瘤干细胞密切相关。最近报道发现一种CD4⁺FoxP3⁺且表达IL-17的调节性T细胞，可以协同低氧，调控肿瘤干细胞；也可促进细胞表达肿瘤干细胞的分子标志，诱导肿瘤干细胞生成。但是，这类研究主要是零星报道，而且主要是基于体外实验，且标本种类来源相对单一，还需进一步研究。

巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，与肿瘤干细胞相互作用，对于肿瘤的发生发展发挥一系列直接或者间接的作用。

在肿瘤早期阶段，M1型的巨噬细胞容易浸润于肿瘤当中，分泌一系列促进炎症的分子，抑制肿瘤的发展。而在肿瘤晚期阶段或者在缺氧环境中，M2型巨噬细胞的浸润增加，促进肿瘤的发生发展。巨噬细胞的表型往往直接与其功能相关，因此巨噬细胞的分子表型相比于它们所在的位置有更重要的意义。由于肿瘤浸润巨噬细胞（TAM）和M2型巨噬细胞具有较多相同的特点，因此对于两者的区分较为模糊，尽管严格意义上来说，两者并不相同。M2型TAM可以通过产生一系列的分子促进肿瘤的发生发展，主要包括表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、TGF-β1和碱性成纤维生长因子。M2/TAM目前被认为也是一类重要的免疫耐受相关细胞，并且可以调控肿瘤干细胞的功能。下面简要介绍肿瘤干细胞和巨噬细胞相互作用的相关机制。

2011年，Jinushi等人研究发现肿瘤浸润巨噬细胞可以直接调控肿瘤干细胞。其中乳脂肪球—表皮生长因子E8（MFG-E8）发挥了重要作用。MFG-E8是一种生长因子，广泛参与细胞吞噬，血管生成，免疫耐受等过程。肿瘤浸润巨噬细胞是微环境中MFG-E8的重要来源之一。整合素-αvβ3和αvβ5受体是MFG-E8发挥生物学功能的重要受体之一，而这些受体在肿瘤干细胞中的表达明显上调。肿瘤浸润巨噬细胞可通过MFG-E8与其受体相互作用调节肿瘤干细胞。人和小鼠的肿瘤浸润巨噬细胞可通过MFG-E8激活肿瘤干细胞中的Stat3和Sonic Hedgehog信号，从而使肿瘤干细胞的成瘤性和抗药性增强。此外，肿瘤浸润巨噬细胞和肿瘤微环境中的其他细胞产生的IL-6可与MFG-E8发挥协同效应。

CD44表达于淋巴细胞和许多肿瘤细胞，目前是结直肠肿瘤干细胞的重要标志之一。在功能方面，该分子参与细胞黏附、迁移、T细胞激活、细胞间相互作用等过程。CD44阳性的结直肠癌肿瘤细胞可以使巨噬细胞产生高水平的Osteopontin，Osteopontin可以通过和肿瘤细胞上的受体CD44结合，激活c-jun-NH₂-激酶途径促进结直肠肿瘤细胞成瘤，从而形成一个Osteopontin-CD44的正反馈环路。在这一环路中，肿瘤干细胞和巨噬细胞相互作用，调控环路中的分子表达水平，对于肿瘤干细胞的功能和肿瘤发展有着重要的影响。

肿瘤干细胞在微环境当中同样会与T细胞相互调控。在以人和小神经胶质瘤为标本的实验中证实，T细胞的激活可以使肿瘤干细胞或者干细胞样的细胞具有更强的干细胞特性。相反，肿瘤干细胞可以抑制T细胞的活化与增殖，促进T细胞凋亡。恶性黑色素瘤肿瘤干细胞可以抑制IL-2依赖的T细胞活化。在肿瘤与外周血单个核细胞（PBMC）共培养的体外实验中，肿瘤干细胞可以显著抑制外周血单个核细胞的增殖，其抑制能力明显强于非干细胞肿瘤细胞。而且，IL-2作为重要的毒性T细胞增长、激活和分化的刺激因子，分泌水平显著下调。在恶性胶质瘤当中，类似的结论也同样得到了验证。研究认为肿瘤干细胞对于T细胞增殖的抑制是通过细胞接触和因子分泌两方面实现的。肿瘤干细胞的培养上清液和肿瘤干细胞自身都可以抑制T细胞的增殖。但是阻断与细胞接触抑制机制相关的共刺激抑制分子B7-H1，这种效应可以部分逆转。此外，不仅在抑制增殖方面，与接触抑制相关的B7-H1在肿瘤干细胞促进T细胞凋亡中，同样发挥了重要的作用。当B7-H1被阻断的时候，肿瘤干细胞诱导T细胞凋亡的效应显著降低。

肿瘤干细胞可以自身或促进其他细胞产生较高水平的促血管生成因子、生长因子等细胞因子，例如 VEGF、bFGF、IL-6、IL-8、HGF 、PDGF-BB、G-CSF、SCGF-b、CCL-2、前列腺素 E₂及IL-10等，也可以抑制许多因子的表达，例如IFN-γ、IL-5 等Th1类或Th2类的因子。这些分子的变化既可表现在肿瘤局部，又可表现在远处或循环中。许多分子例如EGF、FGF、HGF、IGF、IL-6、IL-2及TGF-β等又对肿瘤干细胞的维持和扩增有着重要的作用。本章将当前的热点因子和相关现象、通路结合起来，对机制做简要介绍。

上皮间质转化（EMT）是指上皮细胞转化为具有间质表型和功能的细胞的过程。在生理状态下，这一生物学现象对于组织和器官的分化和修复有着十分重要的作用。但是在病理情况下，EMT也可以造成不利的纤维化，促进肿瘤进展，诱导肿瘤干细胞，抵抗凋亡衰老，造成免疫耐受等。发生转化的细胞迁移和浸润能力增强，对抗凋亡能力提高，细胞外基质产生发生变化。目前研究发现，在肿瘤环境中，肿瘤细胞可以在某些因子的作用下，通过上皮间质转化作用，去分化成为肿瘤干细胞样的细胞。在肿瘤环境中，这一过程主要受到TGF-β、低氧、基因和表观遗传学因素等方面的调控。

在有关肿瘤的上皮间质转化的细胞因子研究中，TGF-β是目前认识最为透彻的一个分子。通常在肿瘤的免疫微环境中，TGF-β的水平显著上调。除了肿瘤细胞本身（干细胞和非干细胞），多种免疫细胞和间质细胞都会产生大量的TGF-β。目前研究发现，在肺癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、直结肠癌、肝细胞癌、膀胱癌、肾细胞癌和胃癌患者的血液中，TGF-β浓度升高，并且在多种肿瘤中与预后和转移明显相关。TGF-β已经广泛用于诱导肿瘤干细胞样细胞的研究中。在乳腺癌等多种肿瘤中已经证实TGF-β可以通过诱导EMT对肿瘤干细胞发挥调控作用。TGF-β诱导EMT过程中，涉及多条信号通路。TGF-β受体的激活可以引发多种SMAD蛋白和细胞极性蛋白（PAR）的磷酸化，也可以影响Notch、Wnt和整合素等信号传导通路。近期有研究发现TGF-β与乏氧诱导因子关系密切，可以促进HIF的稳定性，调控肿瘤干细胞。

NF-κB是一类重要的转录因子，在细胞的扩增、炎症和免疫反应等方面发挥着关键性的作用。目前主要发现两大类NF-κB传导通路，即经典型和非经典型。NF-κB与肿瘤干细胞关系密切，许多炎性因子通过对NF-κB的调控，作用于肿瘤干细胞。在肿瘤免疫微环境中，肿瘤本身、各种免疫细胞和间质细胞可以产生大量的TNF-α、整合素、ROS、乏氧诱导因子及TGF-β。这些分子都可以作用于肿瘤干细胞（表6-1），利用NF-κB通路传导信号，以及调控EMT的促进因子，包括Slug、Snail、Twist，影响肿瘤干细胞功能。

血管生成是肿瘤生物学的一个重要的特点。其过程十分复杂，大体上包括内皮机制降解、内皮细胞移行和扩增、管道化、形成新生基底膜等过程，涉及多种细胞和因子。其中血管内皮细胞和肿瘤干细胞的关系较为重要，本章做单独阐述。下面对血管生成相关的细胞因子做简要介绍。

肿瘤干细胞与血管生成具有互相调控作用。与非肿瘤干细胞相比，肿瘤干细胞可以产生更高水平的血管内皮生长因子（VEGF）和基质衍生因子（SDF），招募更多内皮前体细胞（EPC），有着更强的促血管生成能力。但是相当多分子机制与非干细胞肿瘤细胞诱导血管生成类似。其中VEGF具有最强的促进血管生成的作用，目前以该分子为靶点的药物已经被临床所应用。

血管生成对于肿瘤干细胞也有着重要的作用，可以体现在直接和间接两个方面。一方面，血管生成对于肿瘤干细胞具有直接的调控作用，另外血管生成现象也可以通过作用于其他中介，例如通过促进上皮间质转化，调控肿瘤干细胞。在肿瘤免疫微环境中，许多重要的细胞因子参与血管的生成（表6-2），例如VEGF、成纤维生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（PDGF）及TGF-β等。一些物理化学因素或细胞也可以参与到血管生成调控轴的上游或者下游中来。例如肿瘤微环境中的低氧状态可以通过诱导HIF的生成促进血管生成的发生发展。在众多细胞因子中，VEGF是一类非常重要的因子，以小鼠为研究对象的试验中发现以抗VEGF为核心的抗血管生成治疗可以降低肿瘤干细胞的数目和自我更新能力。

在肿瘤免疫微环境中，肿瘤细胞和以巨噬细胞、T细胞为代表的免疫细胞产生大量的IL-6。IL-6是一种具有调控细胞增殖、分化、功能成熟功能的细胞因子。目前，在多达13种肿瘤（肺癌、乳腺癌、直结肠癌、胃癌、恶性黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、肾癌、恶性胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、头颈鳞癌及膀胱癌）患者的血液中发现，该分子显著上调，并且与肿瘤的分期、大小、进展和预后相关。在生理情况下，IL-6家族成员可以调控间质干细胞自我更新和干细胞特征的维持。在肿瘤环境中，IL-6诱导正常的干细胞或者祖细胞产生恶性干细胞的特点：当IL-6减少或其受体的功能被抑制时，肿瘤干细胞样细胞的形成可以显著降低；相反，当IL-6表达水平上升时，肿瘤干细胞的生存能力相应升高。IL-6还可通过促进血管生成间接作用于肿瘤干细胞。

趋化因子是一类主要由细胞分泌的，对免疫细胞等细胞具有趋化和激活作用的细胞因子。在肿瘤的发生发展过程中，许多趋化因子水平异常，对于免疫耐受起关键的作用。目前发现许多趋化因子参与到肿瘤免疫中，对肿瘤干细胞也起关键的调控作用。例如近期有研究发现，活性氧（ROS）可以增加 TGF-β、TNF-α、HIF-1α、MMP-3、TPA、HGF、EGF和一些microRNA促进EMT，直接或间接调控肿瘤干细胞。