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第一节 溶血性贫血的检验
成熟红细胞的寿命约120天，生理条件下主要通过自身对血氧浓度的感受以及激素水平的调节以维持红细胞数量的恒定。溶血性贫血( hemolytic anemia，HA)指由于遗传性/获得性等原因导致红细胞破坏速率超过骨髓造血代偿能力的一类贫血。
一、溶血性贫血的筛查
(一)网织红细胞计数 【原理】
网织红细胞( reticulocyte，Ret)是尚未完全成熟的红细胞，其胞质内尚有嗜碱性的RNA物质，经新亚甲蓝或煌焦油蓝活体染色后呈浅蓝或深蓝色网状结构。
【试剂】
染色液:①新亚甲蓝枸橼酸氯化钠染色液:新亚甲蓝0.1g溶于100ml枸橼酸氯化钠溶液内( 1体积30g/L枸橼酸钠溶液与4体积9.0g/L氯化钠溶液混合)，充分混匀，待染料溶解后过滤;②煌焦油蓝生理盐水染色液:煌焦油蓝1.0g、枸橼酸钠0.4g、氯化钠0.85g，溶于双蒸馏水100ml中，过滤后备用。
【操作】
1.在小试管中加入染色液2滴;再加入静脉血(或末梢血) 2滴，混匀后放置37℃恒温水箱中。
2.10分钟后取1滴混悬液制成涂片。
3.在油镜下直接观察1000个红细胞中Ret数。或以Miller窥盘计数法计数: Miller窥盘(图1-3-1)为一个厚为1mm、直径为19mm的圆形玻片，玻片上用微细刻线画出两个正方形格子，大方格B面积为小方格A的9倍。置于目镜内，计数小方格内红细胞数(将小方格内数得红细胞数乘以9，折算成一个大方格内的红细胞数)和大方格内的Ret数。
图1-3-1 Miller窥盘结构示意图
A为红细胞计数域，B + A为网织红细胞计数域
【结果计算】
1.直接观察法 网织红细胞比例= 
2.窥盘计数法 网织红细胞比例 = 
3.网织红细胞绝对数(个/L) =网织红细胞百分数×红细胞数/L
4.网织红细胞生成指数( reticulocyte production index，RPI)
【参考区间】 1.网织红细胞比例
成年人: 0.005～0.015;新生儿: 0.03～0.06;儿童: 0.005～0.015。
2.网织红细胞绝对数
成年人: ( 24～84)×10 9/L。
3. RPI
2。
【临床意义】
1.增加 表示骨髓造血功能旺盛。见于各类增生性贫血，溶血性贫血增加尤为显著;巨幼细胞贫血、缺铁性贫血分别应用维生素B 12叶酸或铁剂治疗后显著增多，表示有治疗效果;也是放疗和化疗后以及骨髓移植和EPO治疗后骨髓造血功能恢复的指标。
2.减少 常见于骨髓增生受抑抑制、再生障碍性贫血和纯红细胞再生障碍。
3. RPI＞3时，提示溶血性贫血或急性失血性贫血; RPI＜2时，则提示红细胞生成减少所致的贫血。
【注意事项】
1.标本应在4小时内进行处理。置于清洁的棕色瓶中保存，染色液应无沉淀。
2.新亚甲蓝染料为WHO所推荐，着色强且稳定，背景清晰，利于计数;室温＜15℃时，放37℃恒温水箱;用瑞氏-吉姆萨染液复染后，可使Ret计数结果减少。
3.目前临床常用血液分析仪法。使用Miller窥盘时为了控制 CV在10%之内，要求在连续视野中小方格内需要计数的红细胞数见表1-3-1。
表1-3-1 网织红细胞计数达到规定精密度需计数的红细胞数量
(二)血浆游离血红蛋白测定 【原理】
血管内溶血时，血浆游离血红蛋白浓度增高。血红蛋白中亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用，催化过氧化氢释放新生态氧，使无色的邻-甲联苯胺氧化而显蓝色，加酸后呈较稳定的黄色，吸收峰为435nm。采用比色法可知其含量。
【试剂】
1.邻-甲联苯胺溶液 称取邻-甲联苯胺( O-tolidine) 0.2g，溶于冰醋酸60ml，加蒸馏水至100ml，保存于冰箱中，可用数周。
2.1g/L过氧化氢溶液 由30g/L过氧化氢液临用时稀释而成。
3.10%醋酸溶液。
4. Hb标准贮存液 取抗凝血，离心去除血浆，用生理盐水洗红细胞3次，加入比容红细胞等量体积的蒸馏水和半量体积的四氯化碳(或氯仿)，猛烈振摇5～6分钟，高速离心，将上层Hb溶液分离出来，用HiCN方法测其浓度，并用生理盐水调节浓度至100g/L，于低温冰箱保存。临用时稀释成100mg/L的标准应用液。
【操作】
1. Hb标准应用液0.02ml置于标准管内;受检血浆0.02ml置于测定管内;蒸馏水0.02ml置于空白管内。
2.邻-甲联苯胺溶液及1g/L过氧化氢溶液各1.0ml依次分别加入标准管、测定管及空白管内，充分混匀，放置10分钟。
3.于上述3管内分别加入10%醋酸溶液10ml混合，放置10分钟。
4.用435nm进行比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【结果计算】
【参考区间】
＜40mg/L。
【临床意义】
多见于急性的、较严重的血管内溶血。当血管内溶血释放的血红蛋白量超过结合珠蛋白所能结合的量时，血浆中游离血红蛋白升高。
【注意事项】
动物实验证明，急性血管内溶血发生后2小时，其血浆中游离Hb含量可减低一半。因此本试验应于溶血后即时取样检测，且应注意采样及分离血浆过程不得发生溶血。
(三)血清结合珠蛋白测定 【原理】
结合珠蛋白( haptoglobin，Hp)，能与游离的血红蛋白结合，生成Hb-Hp复合物，在血红蛋白降解代谢过程中具有重要作用。在被检血清中加入一定量的Hb，待与血清中Hp结合生成Hp-Hb复合物后，通过电泳法将已结合的Hb-Hp复合物与未结合的游离Hb分开，以比色反应测定两条区带中血红蛋白的含量，Hp对Hb的结合量能间接反映血液中Hp的含量，用mgHb表示。
【试剂】 1.30g/L Hb溶液
制备Hb标准贮存液(见“血浆游离血红蛋白测定”)，准确稀释成30g/L的浓度。
2. TEB缓冲液( pH 8.6)
取Tris 55g，EDTA l7g，硼酸12g，用蒸馏水配成1000ml，即为贮存液。用前将贮存液稀释3倍为电泳槽缓冲液，稀释6倍为浸膜缓冲液。
【操作】
1.取被检血清0.09ml，加30g/L Hb液0.01ml，混匀，置37℃水浴20分钟。
2.取上述温育液20μl，点样于已浸透TEB缓冲液的醋酸纤维素薄膜(简称醋纤膜，8cm×3cm)离阴极1cm处，同法共作两张膜，将膜条架在电泳槽支架上。
3.在120～140V条件下电泳。一般在通电40分钟后就可观察分出两条Hb区带，前面的(相当于α 2-球蛋白位置)是Hb-Hp区带，后面的(相当于β-球蛋白位置)是未结合的游离Hb区带。
4.待两条区带明确分辨后关闭电源，取下醋纤膜，立即剪下Hb-Hp区带和未结合Hb区带，分别用3ml生理盐水洗脱，20分钟后，用分光光度计在415nm波长下测定吸光度，按下式计算结果:
【结果计算】
【参考区间】
164名健康成人的测定结果，血清Hp含量为( 731±420) mg Hb/L。其中男54人，Hp含量( 742±360) mg Hb/L;女110人，Hp含量( 726±372) mg Hb/L。
【临床意义】 1.减低
各种溶血性贫血，血清Hp含量都明显减少甚至缺如。肝细胞损伤性病变、传染性单核细胞增多症和先天性无Hp血症等，Hp均可下降。
2.增高
见于阻塞性黄疸。各种感染、恶性疾病和组织损伤，以及肾上腺皮质激素或雄性激素治疗后。
【注意事项】
1.标本切勿溶血，否则结果偏低。电泳时温度过高时区带分辨效果欠佳。
2.宜做2份平行试验。当Hb-Hp区带难以观察时，将另一张醋纤膜用联苯胺染色后(参见本章“血红蛋白区带电泳分析”)后辅助判别。Hp降低的标本Hb-Hp区带色泽很浅而细;溶血性贫血时Hb-Hp区带可以消失;当严重血管内溶血时，在Hb-Hp区带位置前面可能出现一条呈暗红色的高铁血红素白蛋白区带，则需慎重确认。
3. Hp含量受内分泌影响，女性患者最好在非月经期进行; Hp为急性时相反应蛋白，检测结果宜结合临床表现综合分析。
4.醋纤膜电泳法属经典方法，现可采用免疫散射比浊法定量检测Hp，操作规程见厂家试剂盒说明书。
(四)尿含铁血黄素试验 【原理】
尿含铁血黄素试验也称Rous试验。当血管内红细胞被大量破坏时，血红蛋白可直接通过肾脏滤过。久之铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其高铁离子与亚铁氰化钾作用，在酸性环境下产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀。
【试剂】 1.20g/L亚铁氰化钾溶液
取亚铁氰化钾0.2g，溶于10ml蒸馏水中。按需要量临时配制。
2.盐酸溶液
取2ml浓盐酸与98ml蒸馏水混合。
【操作】
1.取混匀的新鲜尿液10ml加入试管中，以2000r/min离心5分钟，弃去上清液。
2.在沉淀中加入亚铁氰化钾溶液和盐酸溶液各2ml，混匀后室温下静置10分钟。
3.再以2000r/min离心5分钟，弃去上清液，取沉淀物滴片。
【结果判定】
加盖片后，以油镜观察:有分散或成堆蓝色颗粒(直径1～3μm，尤其存在于细胞内)，为阳性。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
阳性结果主要见于慢性血管内溶血，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症。也见于溶血性输血反应、机械性红细胞损伤、烧伤、药物性溶血和重型血红蛋白病等。血管内溶血初期，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素，可呈阴性反应。
【注意事项】
宜取患者晨尿，以提高阳性率;标本在放置时，建议以封口膜封口以免污染。所有器材必须不含铁，否则造成假阳性结果。分析中同时应作阴性对照。
二、红细胞膜缺陷的检验
(一)红细胞渗透脆性试验 【原理】
正常的红细胞为双凹圆盘形，若将红细胞置于低渗溶液中，因细胞内外存在渗透压差，水分子进入红细胞，使其发生肿胀，乃至红细胞破裂而发生溶血。红细胞在低渗盐溶液中出现溶血的特性即红细胞渗透脆性，其主要取决于红细胞的表面积与体积之比。表面积大而体积小者对低渗盐水溶液的抵抗力较大(脆性较小)，反之则抵抗力较小(脆性增加)。
【试剂】
10g/L氯化钠贮存液:精确称取经100℃烘干、且在干燥器中密闭保存的分析纯氯化钠1.000g，置100ml容量瓶中，加适量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至刻度。
【操作】
1.取清洁干燥小试管14支，各管按表1-3-2加蒸馏水和10g/L氯化钠溶液。
2.用干燥灭菌注射器取被检者静脉血1ml，针头斜面向上，平执注射器，通过针头在每管加入1滴全血，轻轻摇匀;以同样方法取正常人血加于正常对照组试管。
3.将各管静置室温中2小时，从高浓度开始观察全部14管溶血现象。
表1-3-2 氯化钠溶液稀释表
【结果判定】
开始溶血管:上清液初现浅红色，管底尚有多量未溶红细胞;完全溶血管:全管溶液皆呈深红色，管底无红细胞或余红细胞残骸。记录各管相应氯化钠浓度。
【参考区间】 1.开始溶血
3.8～4.6g/L。
2.完全溶血
2.8～3.2g/L。
【临床意义】 1.渗透脆性增加
见于遗传性球形红细胞增多症和遗传性椭圆形红细胞增多症，亦可见于自身免疫性溶血性贫血。
2.渗透脆性减低
见于各型珠蛋白生成障碍性贫血，HbC、HbD、HbE病，缺铁性贫血，脾切除术后及其他一些红细胞膜有异常的疾病如肝脏疾病等。
【注意事项】
1.每次检测均应有正常对照，正常对照与被检者氯化钠浓度相差0.4g/L，即有诊断价值。在乳白色背景下观察、判断完全溶血管，必要时可离心后观察。黄疸患者开始溶血管不易观察，严重贫血患者红细胞太少，皆可用等渗盐水将红细胞洗涤后再配成50%红细胞悬液进行试验。
2.氯化钠必须干燥、称量精确，用前新鲜配制。所用器材必须清洁干燥。
3.不能用枸橼酸盐或双草酸盐作抗凝，以免增加离子强度，影响溶液的渗透压。
(二)红细胞孵育渗透脆性试验 【原理】
将患者血液置于37℃孵育24小时，使红细胞代谢继续进行。由于能源葡萄糖的消耗，贮备的ATP减少，导致需要能量的红细胞膜对阳性离子的主动传递受阻，造成钠离子在红细胞内集聚，细胞膨胀，孵育渗透脆性增加。有细胞膜缺陷及某些酶缺陷的红细胞能源(葡萄糖和ATP)很快耗尽，红细胞孵育渗透脆性明显增加。
【试剂】
9g/L氯化钠磷酸盐缓冲液( pH 7.4)
NaCl ( AR) 9g
Na 2HPO 4( AR) 1.365g (或Na 2HPO 4·2H 2O 1.712g)
NaH 2PO 4( AR) 0.184g (或NaH 2PO 4·2H 2O 0.243g)
蒸馏水加至1000ml。
此氯化钠磷酸盐缓冲液的氯化钠浓度为9g/L，但其渗透压相当于10g/L氯化钠溶液。
【操作】
1.取肝素抗凝静脉血2ml，分为2份，1份立即试验;另1份加塞在37℃温育24小时再做试验。
2.将氯化钠磷酸盐缓冲液按表1-3-3稀释成不同浓度。
3.每管加肝素抗凝血0.05ml，轻轻颠倒混匀，放置室温( 20℃左右) 30分钟。
4.分别将各管混匀1次，然后离心取上清，用分光光度计波长540nm，以9g/L氯化钠磷酸盐缓冲液调零，测定各溶血管上清液的吸光度。
表1-3-3 氯化钠磷酸盐缓冲液稀释表
【结果计算】 1.溶血百分率
以1.0g/L NaCl完全溶血管的吸光度为100%，从各管的吸光度计算出相应氯化钠浓度的溶血百分率。
2.红细胞中间脆性( mean corpuscular fragility，MCF)
以溶血百分率为纵坐标、氯化钠浓度为横坐标作溶血曲线图，即为红细胞盐水渗透脆性曲线。在曲线上，50%溶血的氯化钠浓度为红细胞中间脆性。
【参考区间】 1.未孵育
50%溶血为4.00～4.45g NaCl/L。
2.37℃孵育
24小时50%溶血为4.65～5.90g NaCl/L。
【临床意义】
同红细胞渗透脆性试验。由于本法灵敏度相对较高，多用于轻型HS的诊断和鉴别诊断。
【注意事项】
1.所用的试剂及试管应先消毒，试管应加塞;每次试验应作正常对照。
2.试剂pH及温度必须恒定，pH改变0.1或温度改变5℃，均可使结果改变0.01%。
(三)红细胞自身溶血试验及其纠正试验 【原理】
红细胞自身溶血试验及其纠正试验是测定患者血液在37℃孵育48小时后，自发产生的溶血程度。遗传性非球形细胞溶血性贫血患者由于细胞内酶缺陷，糖酵解发生障碍，能量供应不足，不能维持红细胞内的钠平衡，使患者红细胞在自身血清中经温育后逐渐发生溶血。
【试剂】
1.100g/L葡萄糖(无菌)。
2.等渗盐水(无菌)。
3.氰化高铁血红蛋白稀释液(见本篇第一章中“血红蛋白测定”)。
4.0. 4mol/L三磷酸腺苷 ( adenosine triphosphate，ATP)生理盐水(无菌) 称取ATP 2.5g溶于10ml无菌生理盐水中，用无菌14g/L NaHCO 3液调节至pH 6.8。
【操作】
1.取4支小试管(每管加1g/L肝素0.02ml，高压灭菌后烘干)，测定管编1、2、3、4号。
2.取静脉血4.0ml，分别加入各试管内1.0ml。
3.在1、2、3号管中按表1-3-4所示加入试剂，置37℃温育后分离血浆制备各测定管; 4号管即放4℃冰箱内保存，制备“全溶血对照管”。
表1-3-4 自身溶血试验及其纠正试验操作表
4.再将4号管血液离心后，取血浆0.2ml加HiCN稀释液4.8ml为空白对照管。分光光度计波长540nm处，用空白对照管调零，读取上述各管吸光度值( A)。
【结果计算】
式中分子是将测定管A值乘以血浆比容，换算成稀释到全血量时的吸光度。式中分母乘4是溶血对照管稀释100倍、测定管稀释25倍的系数。若溶血明显，A值过大，可增加稀释倍数。
【参考区间】
正常人血液在无菌条件下孵育48小时后，溶血率＜4.0%;加葡萄糖或ATP后，溶血率＜0.6%。
【临床意义】
各类溶血性贫血自身溶血试验及其纠正试验结果见表1-3-5。
表1-3-5 自身溶血试验及纠正试验结果(溶血率%)
【注意事项】
所有试剂和器材必须灭菌，操作严守无菌规程。
(四)酸化甘油溶血试验 【原理】
在微酸性含甘油的缓冲液中，由于甘油与膜脂质的亲和性等能与膜脂质发生化学反应，从而导致红细胞发生缓慢溶血，并随细胞溶解的增加显现吸光度逐渐下降。当光密度下降为起始吸光度一半时所需时间，即为酸化甘油溶血试验( AGLT 50)。
【试剂】 1.0. 1mol/L磷酸盐缓冲液
取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液49ml和0.1mol/L磷酸二氢钾51ml混匀，调节pH至6.85，每10ml分装，－20℃保存。
2.等渗磷酸缓冲盐液
取0.1mol/L磷酸缓冲液10ml和0.154mmol/L氯化钠溶液90ml混合，4℃可保存一周。
3.0. 3mol/L甘油试剂
取纯甘油1.1ml加入等渗磷酸缓冲盐液16ml，混匀后转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，4℃可保存1个月。
【操作】
1.开启分光光度计，预热20分钟，使得温度准确，读数稳定;试剂置于25℃水浴平衡20分钟。
2.取离体4～8小时肝素抗凝血20μl，加入5ml等渗磷酸缓冲盐液中，配成红细胞悬液，其浓度以起始吸光度0.40～0.60为宜。
3.取3ml等渗磷酸缓冲盐液比色调零，温度25℃，波长625nm，光径1.0cm。
4.取0.3mol/L甘油试剂2.0ml，加入另一光径1.0cm比色皿中，再取已配制的红细胞悬液1.0ml吹入甘油试剂中。同时开启秒表，快速颠倒混合两次后测起始吸光度( 10秒时)，并记录。
【结果判定】
每间隔20秒，至290秒连续读取吸光度并记录之。以起始吸光度值下降一半的时间为AGLT 50结果。
【参考区间】
AGLT 50＞290秒。
【临床意义】
遗传性球形红细胞增多症AGLT 50缩短;该试验较为灵敏，可以检出渗透脆性试验阴性的患者。自身免疫性溶血性贫血患者可有异常。
【注意事项】
1.标本采集顺利，混匀时动作轻柔，避免发生溶血和破坏红细胞;标本采集后在室温静置4～8小时，静置时间不足容易出现中间值。
2.酸化甘油试剂的pH 6.85为宜，pH的改变会导致红细胞膜电荷的改变，相互的排斥力减弱，易聚集而加速沉降。
3.控制实验温度为25℃±2℃，温度过高AGLT 50太长，吸光度变化慢，不便于观察;温度低于20℃，则AGLT 50缩短，出现假阳性。每次试验中应做正常对照。
三、红细胞酶缺陷的检验
(一)高铁血红蛋白还原试验 【原理】
当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)含量不足或缺乏时，由磷酸戊糖代谢途径生成NADPH减少，致高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原为Hb。高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。
【试剂】
1.0. 18mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混合溶液 亚硝酸钠1.25g、葡萄糖5.0g、蒸馏水溶解并加至100ml，贮存于棕色瓶中，放4℃冰箱，可保存1个月。
2.0. 4mmol/L亚甲蓝溶液 亚甲蓝(含3个结晶水) 0.15g，蒸馏水加至100ml。先将亚甲蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml容量瓶中，再加蒸馏水至100ml，混匀过滤，此液可贮存3个月。
3.0. 02mol/L磷酸盐缓冲液( pH 7.4) 磷酸氢二钠229.5mg、磷酸二氢钾52.2mg、蒸馏水加至100ml。或用0.0667mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释3倍。
4.109mmol/L枸橼酸钠溶液( 32g/L)。
【操作】
1.在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml，静脉血1.8ml，混匀。
2.离心15分钟，取出，调整血细胞与血浆比例为1∶1后再混匀。
3.取上述抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3小时。
4.孵育后混匀，取血0.1ml，加pH 7.4磷酸盐缓冲液10ml，混匀，2分钟后在波长635nm处测定吸光度(设为SA)。
5.空白对照，用未加亚硝酸钠葡萄糖的血液，同样孵育后取0.1ml，加pH 7.4磷酸盐缓冲液10ml，2分钟后测定吸光度为B。然后加入亚硝酸钠葡萄糖混合溶液1滴，混匀，5分钟后再测其吸光度为ST，此为高铁血红蛋白对照。
【结果计算】
式中: SA-B、ST-B分别为还原后和还原前高铁血红蛋白的吸光度; SA-B/ST-B为还原后剩余高铁血红蛋白的比值。
【参考区间】
高铁血红蛋白还原率＞75%。
【临床意义】
蚕豆病和伯氨喹啉型药物溶血性贫血患者由于G-6-PD缺陷(隐性遗传)，高铁血红蛋白还原率明显下降，纯合子≤30%，杂合子多为31%～74%。
【注意事项】
1. Hct＜30%时，高铁血红蛋白还原率显著降低，须调整红细胞与血浆的比例。
2.因草酸盐具有还原性，不宜作抗凝剂。
(二)变性珠蛋白小体试验 【原理】
变性珠蛋白小体( Heinz小体)是一种变性血红蛋白颗粒，被某些碱性染料染成紫色或蓝黑色点状物。
【试剂】
10g/L结晶紫生理盐水溶液 取结晶紫1.08g、NaCl 0.85g、蒸馏水100ml，用乳钵研磨溶解后过滤使用。
【操作】
1.取结晶紫生理盐水溶液0.5ml，加末梢血2～3滴，混匀，置37℃水浴5分钟。
2.取出1滴于载玻片上，加盖玻片后用油镜观察。
3.计数500～1000个红细胞，报告Heinz小体阳性红细胞的百分率。
【结果判定】
红细胞内有散在的或附着在膜上的圆形紫黑色颗粒(大小为0.3～2μm)者为阳性。
【参考区间】
＜1%。
【临床意义】
增高见于G-6-PD缺乏所致的蚕豆病、伯氨喹啉类药物所致的溶血性贫血和不稳定Hb病等。
(三)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验 【原理】
在葡萄糖-6-磷酸和辅酶Ⅱ( NADP)存在下，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶( glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)能使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。
【试剂】
混合试剂的成分与配方如下:
0.1mol/L G-6-P 1ml
7.5mmol/L NADP 1ml
0.7mol/L Tris-HCl ( pH 7.8) 3ml
8mmol/L氧化型谷胱甘肽 1ml
10g/L皂素 2ml
蒸馏水 2ml
此混合试剂分装后置20℃保存，可稳定数月。
【操作】
1.标本采集 EDTA-Na 2、ACD或肝素抗凝全血，若置4℃保存，可稳定1周。亦可用肝素化毛细管从手指或足跟采取末梢血液。
2.取12mm×75mm试管3支，标明患者、正常对照和阳性对照。向各管加入混合试剂200μl。
3.向各管分别加入患者、正常和阳性的抗凝全血20μl，混匀后置25℃室温中。
4.在反应0分钟(混匀后立即吸出)、5分钟和10分钟时，分别从各管吸出反应液1滴，加于新华1号滤纸上，使充分干燥。
【结果判定】
在暗室内，用波长260～340nm的紫外线分别照射晾干后滤纸上的斑点，观察有无荧光。
【参考区间】
5分钟和10分钟斑点出现荧光，而10分钟斑点荧光最强。
【临床意义】
正常人有甚强的荧光。G-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光;杂合子或某些G-6-PD变异体者则可能有轻到中度荧光。
【注意事项】
1.本法是直接测定NADPH的量，特异性较好。
2.每次或每批宜有G-6-PD正常和缺陷者的标本作对照。
(四)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定 【原理】
红细胞G-6-PD催化葡萄糖-6-磷酸( G-6-P)生成6-磷酸葡萄糖-δ-内酯，后者很快氧化成6-磷酸葡萄糖酸( 6-PGA)，同时NADP被还原成NADPH。反应式如下。在波长340nm处监测NADPH的吸光度增高，直接计算葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。
【试剂】 1.0. 27mol/L EDTA溶液( pH 7.0)
100.5g EDTA-Na 2·2H 2O溶液调节至pH 7.0，再加蒸馏水至1000ml。置4℃冰箱保存，可稳定1年。
2.稳定液
0.25ml β-巯基乙醇，加0.27mol/L EDTA溶液5ml，用氢氧化钠或盐酸调节至pH 7.0。然后用蒸馏水稀释至500ml，置4℃冰箱保存，可稳定1个月。
3.1mol/L Tris-HCl缓冲液( pH 8.0，含5mmol/L EDTA)
向400ml蒸馏水中加入60.6g Tris ( MW121.14)， 0.93g EDTA-Na 2·2H 2O ( MW372.24)，用0.1mol/L HCl调节至pH 8.0，再加水至500ml。置4℃冰箱保存，可稳定1年。
4.0. 1mol/L MgCl2溶液
10.2g MgCl·6H 2O ( MW203.31)，加蒸馏水至500ml。置4℃冰箱保存，可稳定1年。
5.2mmol/L NADP溶液
β-NADP钠盐( MW765.4) 10mg，溶于6.5ml蒸馏水中，置4℃冰箱保存，可稳定1天(注: Sigma公司有预称的β-NADP钠盐供应，每瓶有1mg、5mg和10mg三种规格)。
6.反应混合液
1mol/L Tris-HCl缓冲液 6ml
0.1mol/L MgCl 2溶液 6ml
2mmol/L NADP溶液 6ml
蒸馏水 34.8ml
分装成6ml一份，冷冻保存，至少可稳定1个月。
7.6mmol/L G-6-P溶液
称取G-6-P钠盐( MW282.1) 17mg，加1mol/L Tris-HCl缓冲液10ml。分装成每份0.8ml，冷冻保存。
8.氰化高铁血红蛋白测定试剂
购商品试剂盒。
【操作】
1.溶血液制备 新鲜抗凝血，离心去除上清及白细胞层，用4℃冷生理盐水洗涤2次，每次离心去上清时，务必吸去剩余的白细胞层，再加冷生理盐水配成含血细胞比容为30%的红细胞悬液，置冰水浴中备用。用时以蒸馏水作25倍稀释制备溶血液。
2.溶血液Hb含量用氰化高铁血红蛋白法测定。
3.按照表1-3-6操作。
表1-3-6 G-6-PD测定操作步骤
4.各管混匀，置37℃孵育10分钟，向各管加入6mmol/L G-6-P溶液100μl，混匀。以分光光度计(波长340nm，比色杯光径10mm，温度37℃，以空白管调零)每隔1分钟读取1次测定管的吸光度，共读6次。根据5分钟的连续吸光度的变化，计算出每分钟吸光度增量(ΔA/min)。
【结果计算】
【参考区间】
成人红细胞G-6-PD活性为8～18U/g Hb。
【临床意义】
G-6-PD缺乏或减少见于G-6-PD缺乏症、药物反应、蚕豆病和感染等。诊断有效性较高。
【注意事项】
1.将全血标本保存于4℃，可达数天;但溶血液配制后应尽快测定。4℃可保存8小时;－20℃可保存48小时。
2.如连续6次吸光度中，各ΔA/min间相差较大，应增加读数次数，直至连续5次ΔA/min读数间接近为止。
(五)丙酮酸激酶荧光斑点试验 【原理】
丙酮酸激酶( pyruvate kinase，PK)在二磷酸腺苷( adenosine diphosphate，ADP)存在的条件下催化磷酸烯醇丙酮酸( phosphoenolpyruvate，PEP)继而转化为丙酮酸，在乳酸脱氢酶( LDH)作用下丙酮酸转化为乳酸，同时还原型辅酶Ⅰ( NADH，有荧光)氧化为辅酶Ⅰ( NAD，无荧光)。在紫外线照射下检测此过程荧光消失的时间可反映PK的活性。
【试剂】 1.0. 15mol/L PEP液
取144.3mg PEP溶于2ml蒸馏水中上，用0.2mol/L的NaOH液调节pH为7～8，冷藏备用。
2.0. 015mol/L NADH液
NADH 10.5mg，溶于1ml蒸馏水中，并用0.2mol/L的NaOH液调节pH为7～8，冷藏备用。
3.0. 08mol/L硫酸镁溶液
MgSO 4·7H 2O 98mg溶于5ml蒸馏水中。
4.0. 25mol/L磷酸盐缓冲液( pH 7.4)
取80ml 0.25mol/L K 2HPO 4和20ml 0.25mol/L KH 2PO 4混合，调节至pH 7.4。
5.0. 03mol/L ADP液
取ADP二钠盐150mg溶于5ml蒸馏水，用0.2mol/L的NaOH液调节pH为7～8，－20℃冻存。
6.反应液(临用新配)
0.15mol/L PEP 30μl
0.015mol/L NADH液 0.1ml
0.08mol/L MgSO 4溶液 0.1ml
0.25mol/L磷酸盐缓冲液0.05ml
0.03mol/L ADP液 0.1ml
蒸馏水 0.62ml
混匀待用。
【操作】
1.取肝素抗凝血2ml，120×g离心5分钟，弃去血浆和乳白色层，用生理盐水洗涤红细胞3次。取1体积比容红细胞用4体积生理盐水配成20%的悬液。
2.配制好的红细胞悬液放于－20℃以下冷冻，再在室温中复溶，红细胞溶解。
3.取反应液200μl置于小试管中，再加上述溶血液20μl，充分混匀后于37℃温育。
4.在温育开始( 0分钟)和温育后25分钟、35分钟、45分钟和60分钟分别取一小滴混合液点于滤纸上，晾干后观察结果。
【结果判定】
于紫外线灯下观察斑点的荧光。
【参考区间】
荧光在25分钟内消失。
【临床意义】
荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶缺乏，中度缺乏(杂合子)时，荧光25～60分钟消失，严重缺乏(纯合子)时，荧光60分钟不消失。
【注意事项】
1.每次检测应采用已知PK正常的标本作为正常对照，利于结果观察判断。
2. NADH配制后不稳定，用前应以340nm的光吸收进行校正，以上配制好的NADH液经1∶1000稀释后吸光度约为0.093。
(六)丙酮酸激酶活性测定 【原理】
通过检测NADH转变为NAD速率从而反映PK的活性。NADH在340nm波长下有一特定吸收峰，而NAD没有此吸收峰，在此波长下，检测NADH减少的速率，可推算丙酮酸激酶活性。
【试剂】
1.1mol/L Tris-HCl缓冲液(含5mmol/L EDTA)，pH 8.0。
2.1mol/L氯化钾溶液。
3.0. 1mol/L氯化镁溶液。
4.2mmol/L NADH液 称取NADH 1.4mg溶于1ml蒸馏水中。
5.30mmol/L ADP液 取ADP二钠盐150mg溶于5ml蒸馏水中。
6.60U/ml乳酸脱氢酶液 取LDH液活性单位调至60U/ml。
7.50mmol/L PEP溶液 取24.05mg磷酸烯醇丙酮酸氨盐溶于1ml蒸馏水，4℃冷藏备用。
【操作】
1.取肝素抗凝血3.5ml，加右旋糖酐1ml，静置后弃去血浆。再加右旋糖酐1ml、生理盐水补足至4.5ml洗涤红细胞，反复洗涤4～6次，再将无白细胞的红细胞液用生理盐水洗2次。
2.将洗涤后红细胞悬液加入冰浴的蒸馏水，制成1∶20的溶血液，测定血红蛋白。冰浴备用。
3.在1ml反应系统中按表1-3-7加入试剂及标本。
4.在37℃恒温条件下，测定吸光度的变化，波长340nm，蒸馏水调零，每分钟测定1次，连续测定10分钟。
表1-3-7 PK活性测定的操作
【结果计算】
式中，ΔA:为每分钟的吸光度变化;
V C:测定体系的总体积，本试验为1ml;
Hb:溶血液的血红蛋白浓度;
6.22: 1mmol/L的NADPH在340nm的吸光度值;
V H:加入溶血液的量，本试验为20μl。
【参考区间】
成人为( 15.0±1.99) U/g Hb。
【临床意义】
1.先天性PK缺乏，PK活性率降低或消失，纯合子的PK值在正常活性的25%以下，杂合子为正常25%～50%。
2.继发性PK缺乏，如白血病、再生障碍性贫血、MDS等，PK活性可减低。
【注意事项】
1.血液标本要新鲜。试剂、pH和试验温度要准确。
2.白细胞、血小板等含的PK酶活性相当高，必须尽可能洗除。
四、血红蛋白病的检验
(一)血红蛋白区带电泳分析 【原理】
各种Hb由于组成珠蛋白的肽链不同而具有不同的等电点，在一定pH的缓冲液中可带不同的电荷。在碱性缓冲液中Hb带负电荷，反之带正电荷。肽链中一个或数个氨基酸被取代或缺失后，有时所带的电荷也随之发生改变。在一定的电场中，带有不同电荷的珠蛋白分子便可分别向正极或负极移动，其迁移的速度也因所带电荷的强弱而不同，结果便在支持介质(醋酸纤维素薄膜/琼脂糖凝胶)中形成各种血红蛋白区带电泳图。观察电泳图便可初步发现各种异常Hb，用比色或扫描的方法，还可测出其含量，对血红蛋白病( Hb病)作出诊断。
【器材】
1.直流稳压电源和微型电泳槽。
2.分光光度计和吸光度扫描仪。
【试剂】 1.浸膜缓冲液( pH 8.5 TEB缓冲液)
取三羟甲基氨基甲烷( Tris) 10.2g，EDTA-Na 2 0.6g及硼酸( boric acid) 3.2g，加蒸馏水溶解，配成1000ml。
2.电泳槽缓冲液
取硼砂6.87g，硼酸5.56g，用蒸馏水配成1000ml。
3.醋酸纤维素薄膜(简称醋纤膜)
剪成6cm× 4cm大小，或根据检测标本的数量剪成6cm长、不同宽度的膜。
4.2g/L丽春红S ( Ponceau S)液
取丽春红S 0.2g，三氯醋酸3g，磺基水杨酸3g，用蒸馏水溶解后稀释至100ml。
5.氨基黑10B染液
①染色液:氨基黑10B 0.5g，加甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml;②脱色液:甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml;③透明液:无水乙醇70ml，冰醋酸30ml。
6.联苯胺染液
称取联苯胺0.1g溶于甲醇10ml中，为贮存液。临用时取贮存液1ml，加醋酸钠缓冲液( 0.8g结晶醋酸钠，加冰醋酸1.2ml，加蒸馏水至500ml) 50ml，再加30% ( V/V) H 2O 21滴和50g/L亚硝基铁氰化钠1滴(或结晶一小粒)，混匀。
【操作】
1. Hb溶液的制备 取抗凝血2ml，按照“血浆游离血红蛋白测定”中“Hb标准贮存液”(四氯化碳法)制备待检Hb溶液;或在试管中加入蒸馏水5滴和全血2滴，振荡后静置30分钟，使红细胞破坏后即为Hb溶液(微量法)。
2.在醋纤膜的无光泽面的一端用铅笔画一横线作点样线(作异常Hb检查时可在距阴极端1.5cm处画线)。在近阳极端写上被检者姓名或检号。
3.浸膜 将醋纤膜浮于TEB缓冲液表面，待其均匀浸湿后沉下浸泡至少15～20分钟，使完全浸透，取出薄膜用滤纸吸去多余的水分。
4.点样 用薄盖玻片或废X线胶片蘸取待检50～100g/L Hb溶液3～4μl，印在点样线的中间，也可用微量加样器吸取Hb溶液约2μl点样，点样要求匀、直、细。同法以正常Hb溶液平行点样作对照。如采用比色法定量检测，则需另取一醋纤膜，点样10～20μl。
5.电泳 将等量硼砂硼酸缓冲液加入电泳槽两端的缓冲液槽内并使两端液面平衡。用两层滤纸或纱布作桥搭在两边醋纤膜支架上，将已点好样的薄膜安放在电泳槽支架板的滤纸桥上，点样面向下，点样端接负极，加盖，平衡5～10分钟后接通电源，调节电压在200～250V，电流在0.3～0.4mA/cm，薄膜两端电势梯度约为25V/cm，通电25～45分钟，待各类Hb区带分离。
【结果判定】
正常人Hb电泳谱可显出4条区带，最近阳极端量最多的为HbA，其后为少量的HbA 2。再后有两条更少的红细胞内非Hb蛋白成分NHb1，以及NHb2 (可不显现)。HbF在HbA之后，通常很难与HbA分离开来。在pH 8.5 TEB不连续电泳中，根据各Hb电泳的速度可分6组，见图1-3-2。以HbA为标志，比它快的包括H及J组为快速异常Hb，比HbA慢的包括G、S及E组，属慢速异常Hb。6组Hb的电泳速度与各组中的主要异常Hb见表1-3-8。如果氨基酸的替代或缺失并未引起Hb分子电荷的改变(如HbM)，则不能用电泳法分离。
表1-3-8 6组Hb电泳速度与分组中常见Hb
图1-3-2 血红蛋白电泳区带分析示意图
注: (－)表示阴极，( + )表示阳极。下一排为正常血红蛋白结果，显示出四种区带: A区带( Hb A)、A 2区带( Hb A 2)及两条非血红蛋白区带( NHb1和NHb2) ;上一排为异常Hb电泳结果，出现病理性Hb条带，如Hb H区带、Hb J区带、Hb E区带等
在筛选异常Hb时宜用氨基黑或丽春红染色，发现异常的Hb区带后要用联苯胺染色证实。①氨基黑染色:将已电泳的薄膜浸入氨基黑染液中，随时翻动，避免重叠，染色15分钟后移入盛有脱色液的平皿中浸泡漂洗，更换脱色液数次，直至薄膜上背景染液洗净为止，取出，将其贴在玻璃板上，待自然干燥;②丽春红S染色:将薄膜浸入丽春红S液中染色约10分钟，移入3%～5%的醋酸中，漂洗至背景无色，取出贴在玻板上待阴干;③联苯胺染色:薄膜先用70g/L三氯醋酸或100g/L磺柳酸液固定5分钟，充分水洗，浸入联苯胺液中染数分钟，待Hb区带清晰显现后，用水洗净或用脱色液洗净。
【结果计算】
临床上Hb区带还需定量分析。
1.直接比色法
以Hb A 2定量测定为例。分别剪出膜条中的Hb A和Hb A 2区带，放入2支试管中。Hb A管中加蒸馏水20ml，Hb A 2管中加蒸馏水4ml。浸泡30分钟，不时摇动。待血红蛋白完全洗脱下来后，混匀，用分光光度计(波长413nm)读取吸光度(蒸馏水校正零点)，以下式计算出结果。
2.染色后比色法
以异常Hb定量为例。将经氨基黑染色的各Hb区带剪下，分别置入带塞试管中，加入0.4mol/L NaOH液: Hb A管4ml、Hb A 2管2ml、异常Hb管2ml或酌情减少(如用1ml比色，计算时吸光度值除以2) ;另剪一块与A 2区带面积相同的空白薄膜，加0.4mol/L NaOH液2ml为空白对照。其间不时摇动试管，在室温中洗脱15～20分钟，待各区带色泽完全洗脱至碱液中。再以空白管调零，在600nm下用分光光度计分别测定各管的吸光度，按下列公式算出各异常Hb的百分比。
3.扫描法
①将经染色处理后彻底干燥的薄膜浸入透明液中浸泡15～20分钟，取出立即小心地平贴在玻板上阴干即成透明标本;②将已染色透明干燥的醋纤膜放在吸光度仪上扫描;③自动分辨并显示Hb区带吸光度，定量分析各区带的Hb含量。
【参考区间】 1. Hb区带电泳
未发现异常Hb区带。
2. Hb A2定量
正常成人为1.05%～3.12%。
【临床意义】
1.通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带，如Hb H、Hb E、Hb Bart's、Hb S、Hb D和Hb C等异常血红蛋白，应进一步定量检测。Hb H在pH 6.5电泳时仍向阳极移动( Hb Bart's位于膜中间点样线)，而其他Hb均泳向阴极。
2. Hb A 2升高，是β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者的特征性标志，故Hb A 2定量的准确与否，对于临床上β-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者的筛查至关重要。Hb A 2增高至4%～8%，多数为轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血;若增高至10%以上提示为Hb E。其他一些疾病如肿瘤、疟疾、甲状腺功能亢进、Hb S病等，Hb A 2也可轻度增高。
3. Hb A 2减低 遗传性Hb F持续存在综合征( HPFH)、α-珠蛋白生成障碍性贫血、δ-珠蛋白生成障碍性贫血患者的Hb A 2含量较低。缺铁性贫血患者的Hb A 2常降低，借此可与轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血鉴别。
【注意事项】
1.血红蛋白电泳一般采用微量法制备标本，宜稀释1～2倍，这样会使区带更为清晰、整齐; Hb A 与Hb A 2之间应距离6mm以上的空白区域。定量分析应以四氯化碳法制备血红蛋白溶液，点样量约10μl，对于中度或重度贫血的病例，点样量应增大为至20μl，以提高检测结果准确度。血红蛋白溶液置于4℃保存不能超过1周。冷冻时可保存几个月，但不宜反复冻融，否则将导致变性。
2.点样量要适当，也不要达到膜的边缘引起拖尾。过多则分辨不清;染色液不易染透，染色色带容易脱落。过少Hb A 2(或异常Hb区带)吸光度太低，影响准确性。
3.要避免Hb以外的标本污染醋纤膜。浸膜时应漂浮在浸膜液中缓缓浸透，避免产生气泡。
4.严格控制缓冲液离子强度、染液质量和浓度、染色时间、漂洗次数以及电泳时电流、电压和时间等，电泳槽中的缓冲液不能长期使用，否则可影响电泳的分析结果。
5.每次试验均应加入已知正常标本和异常标本，分别做阴性对照和阳性对照。
6.室温低时染色时间应延长。气温高时洗脱时间不宜过长，否则洗脱碱液蓝色渐褪，并逐步变为紫红色。洗脱后要尽快比色，超过半小时可能因逐渐褪色而影响结果。
7.随着全自动电泳仪的出现，Hb电泳现多用分辨率更高且便于扫描定量的琼脂糖凝胶电泳取代醋纤膜法。操作程序见仪器制造厂家使用说明书。
(二)血红蛋白组分色谱分析 【原理】
色谱分析( chromatography)又称色谱法、层析法。其利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
【操作方法及结果计算】
目前Hb色谱分析法已实现高通量全自动化，各生产厂家均提供规范操作规程。严格按试剂盒说明书进行。
【参考范围】
成人Hb A 2为1.41%～3.61%。各实验室宜进行验证。
【临床意义】
同Hb区带电泳法。以高效液相色谱法进行Hb组分分析为当前国际公认的主流技术，典型Hb组分色谱分析见图1-3-3。
图1-3-3 血红蛋白组分色谱图分析案例
A.正常对照; B.β-珠蛋白生成障碍性贫血杂合子; C. Hb E病; D. Hb H病
(三)抗碱血红蛋白测定 【原理】
抗碱血红蛋白( Hb F)抗碱能力比Hb A强，在碱性溶液中，Hb F不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀。测定其滤液中Hb含量，即Hb F的含量。本试验中所使用的半饱和硫酸铵有停止变性反应、降低pH及沉淀蛋白的作用。
【试剂】 1.0. 083mol/L氢氧化钾( pH 12.7)
置塑料瓶中，4℃保存，若有沉淀或混浊，应弃去不用。用前宜进行滴定校正。
2.半饱和硫酸铵
取硫酸铵390g，溶于500ml蒸馏水中，加热溶解，冷却后置室温。饱和硫酸铵溶液中必须有少量硫酸铵结晶在容器底部，才能表示已达饱和。临用前，取饱和硫酸铵4ml，加蒸馏水4ml 及10mol/L盐酸0.02ml。
【操作】
1.血红蛋白液的制备 与血红蛋白电泳检测相同，用四氯化碳法制备。
2.取大试管1支，加0.083mol/L氢氧化钾溶液3.2ml、血红蛋白液0.2ml，立即混匀，准确碱化1分钟，届时立即加入半饱和硫酸铵6.8ml，混匀后用优质滤纸过滤，所得滤液为甲液。
3.另取试管1支，加蒸馏水5ml及血红蛋白液0.02ml，混匀后为乙液。
4.甲液和乙液均用蒸馏水作空白管，用分光光度计540nm波长分别测定吸光度。
【结果计算】
式中51和251分别为甲、乙血红蛋白液的稀释倍数。
【参考区间】
成人1.0%～3.1%。新生儿55%～85%，2～4个月后逐渐下降，1岁左右接近成人水平。
【临床意义】
抗碱血红蛋白明显增高见于β-珠蛋白生成障碍性贫血患者，重型患者可达80%～90%。急性白血病、再生障碍性贫血、红白血病、淋巴瘤等也可轻度增高。
【注意事项】
1.滤液应清澄透明;呈淡黄或淡红色可能为血红蛋白含量高。
2.试验所用试管、吸管等仪器不可沾污酸碱。碱液浓度必须准确，其pH＞12，校准后最好分装密闭保存，使用量和作用时间都必须十分准确。
3.酸性半饱和硫酸铵必须准确配制，其pH应为3.0，宜小批量分装。
4.每次试验宜用正常人血和脐带血( Hb F含量高)作对照试验。
(四) Hb F酸洗脱试验 【原理】
Hb F除抗碱能力强外，抗酸能力也较Hb A为强。因此，经固定后的血片，置酸性缓冲液中保温一定时间，只有含Hb F的红细胞不被洗脱，再用伊红染色而呈鲜红色。
【试剂】
1.80%乙醇。
2.0. 1mol/L枸橼酸 取无水枸橼酸( MW 192.1) 9.6g，溶解于适量蒸馏水中，待完全溶解后，加蒸馏水至500ml。
3.0. 2mol/L磷酸氢二钠 取Na 2HPO 4·12H 2O ( MW 358.07) 35.81g溶于少量蒸馏水中，待完全溶解后，加水至500ml。
4.酸性缓冲液( pH 3.3±0.2) 0.2mol/L磷酸氢二钠12.3ml; 0.1mol/L枸橼酸37.7ml。
5.苏木素染色液 取1g苏木素溶于10ml无水乙醇中，取2g明矾溶于200ml蒸馏水中。混合上述二液，煮沸后即加氧化汞0.5g，再加热至染液变成深紫色，随即放入冷水中，使之变凉，次日过滤。
6.伊红染液 10g/L伊红Y溶液200ml中加1滴冰醋酸。
【操作】
1.按常法制备血涂片，自然干燥1小时，再用80%乙醇固定5分钟(枸橼酸盐抗凝血在4℃冰箱内保存3日内可以使用)，水洗待干。
2.将固定后血膜放37℃、pH 3.3的酸性缓冲液中，保温准确5分钟。
3.冲洗干燥后，在苏木素染液中染白细胞1分钟，以免误认为阳性红细胞。
4.水洗后，用伊红染液染1分钟，再水洗，干后镜检。
【结果判定】
在油镜下，含有Hb F的红细胞被伊红染液染成鲜红色为阳性红细胞;仅留下淡影的细胞膜者为阴性红细胞。仿照网织红细胞计数法，计数1000个红细胞中阳性红细胞所占百分率。
【参考区间】
脐带血几乎所有的红细胞均呈阳性;新生儿阳性率为55%～85%; 1个月后的婴儿为67%; 4～6个月后偶见;成人小于1%。
【临床意义】
β-珠蛋白生成障碍性贫血患者:轻型者(杂合子)仅少数红细胞呈阳性，重型者(纯合子)阳性红细胞明显增多。再生障碍性贫血和其他溶血性贫血也可出现数量较少的阳性红细胞。β-珠蛋白生成障碍性贫血和遗传性Hb F持续综合征患者抗碱血红蛋白均增高，但酸洗脱试验显示前者红细胞染色为红白相间异质性，后者为均匀淡红色，有鉴别诊断意义。
【注意事项】
1.血片中红细胞应平铺分散。制成后，在2小时内染色，否则可出现假阳性反应。
2.缓冲液的pH、温度、洗脱时间应严格，否则影响测定结果。
(五)血红蛋白H包涵体检查 【原理】
血液中加入煌焦油蓝，在37℃孵育后，血红蛋白H ( Hb H)因氧化变性而发生沉淀，呈颗粒状，弥散而均匀地分散在红细胞内，被染成墨绿蓝色，形成血红蛋白H包涵体。
【试剂】
10g/L煌焦油蓝溶液 煌焦油蓝1g、枸橼酸钠0.4g溶于100ml生理盐水中，贮存于棕色瓶中，临用前过滤。
【操作】
取10g/L煌焦油蓝溶液0.5ml，置小试管中，加新鲜血3～4滴，混匀，加塞，置37℃水浴中。在10分钟及1小时用毛细滴管各取1滴血推成薄片，待干后置于油镜下观察。
【结果判定】
Hb H包涵体染色阳性时，在红细胞内出现大小不等、数目不一的墨绿蓝色圆形小体，分布不规则，散在于整个红细胞内。观察孵育1小时后血涂片中1000个红细胞，报告含有Hb H包涵体阳性细胞的百分率。
【参考区间】
0～5%。
【临床意义】
Hb H病患者阳性的红细胞可达50%以上，轻型α-珠蛋白生成障碍性贫血时，偶见Hb H包涵体。
【注意事项】
1.观察结果时，须注意与网织红细胞鉴别，后者一般呈网状或细小点粒状，与煌焦油蓝混合后在10分钟内即显现出来。必要时以孵育10分钟时血涂片进行比较分析。
2. Hb H一般要在10分钟后至1小时内产生包涵体。有些不稳定Hb用本法染色也可产生珠蛋白变性沉淀，形成变性珠蛋白小体，但需孵育更长时间( 3小时或更长)。
(六)红细胞镰变试验 【原理】
血液中加入偏重亚硫酸钠可以降低红细胞的氧张力，Hb S在还原状态下溶解度明显降低，互相聚合成长管状多聚体，使红细胞变成镰形。
【试剂】 1.20g/L偏重亚硫酸钠液
临用时配制，取Na 2SO 5200mg，溶于10ml刚煮沸已冷却的蒸馏水中。
2.凡士林液状石蜡合剂
凡士林与液状石蜡等量混合。
【操作】
1.在清洁载玻片上滴加被检鲜血1滴，加偏重亚硫酸钠液1滴，混匀。
2.加盖片，避免气泡，用凡士林液状石蜡合剂封固，置37℃温箱。
3.同时用正常人血作对照。
【结果判定】
在温育15分钟、30分钟、60分钟、120分钟及24小时后分别用高倍镜观察，有镰状红细胞形成为阳性。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
镰变试验阳性提示存在Hb S。
【注意事项】
1.在温育中不能干涸，必要时可将玻片放在垫有浸湿纱布的平皿内温育。
2.必须连续观察24小时，如均无镰变时才能报告阴性。
(七)异丙醇试验 【原理】
非极性溶剂会使Hb分子内部的氢键减弱，稳定性下降，随时间推移，逐渐显现混浊和絮状沉淀。
【试剂】 1.17% ( V/V)异丙醇溶液
在100ml容量瓶中加17ml异丙醇，然后加0.1mol/L Tris缓冲液( pH 7.4)至刻度，需加盖密封保存。
2. Hb溶液
见血红蛋白电泳，用四氯化碳制备。
【操作】
取2ml 17%异丙醇溶液，置有塞试管中，37℃水浴预热数分钟后，加入0.2ml Hb溶液，加塞混匀，计时观察，同时作正常对照。
【结果判定】
在5分钟、20分钟和40分钟分别观察试管中溶液的混浊或沉淀现象。5分钟清澈、40分钟略有混浊为阴性; 5分钟出现混浊，40分钟之内出现沉淀为阳性; 20分钟观察时即有絮状沉淀则为强阳性。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
本试验阳性提示存在不稳定Hb或Hb H，需作进一步检查。此外，Hb F及高铁Hb也可有混浊发生。
【注意事项】
1.异丙醇溶液浓度( 17%)及温度( 37℃)要严格控制。pH不得低于7.2。
2. Hb液浓度为100g/L ( 70～130g/L)，抗凝剂无影响。
3. Hb液需新鲜配制，久置可转变为高铁Hb，造成假阳性。
(八)热不稳定试验 【原理】
不稳定Hb可在红细胞内发生变性。在体外若将其Hb溶液加热，能够促进发生沉淀现象。
【试剂】 1.0. 1mol/L Tris缓冲液( pH 7.4)
称取Tris 1.21g，加0.1mol/L HCl 40ml，加蒸馏水至100ml。
2.氰化高铁Hb稀释液
NaHCO 31g，KCN 50mg，高铁氰化钾200mg，加蒸馏水至1000ml。
【操作】
1.在试管中将0.5ml待检Hb液和5ml Tris缓冲液混匀。
2.另取2支试管，各加上述混合液2ml。第1管(对照管)置于4℃冰箱;第2管(测定管)在50℃水浴2小时后以3000r/min离心20分钟。
3.各管取0.1ml上清液，各加5ml氰化高铁Hb稀释液，混合，分光光度计于540nm波长处，用空白管( 0.1ml Tris溶液，加5ml氰化高铁Hb稀释液)调零，读取各管吸光度。
【结果计算】
【参考区间】
≤5%。
【临床意义】
阳性结果提示存在不稳定Hb。
【注意事项】
1.以四氯化碳法新鲜制备Hb液。
2.水浴温度恒定，离心时速准确。
五、阵发性睡眠性血红蛋白尿症的检验
(一)酸化溶血试验 【原理】
酸化溶血试验又称Ham试验。阵发性睡眠性血红蛋白尿( paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)患者的红细胞对补体敏感性增高，在酸化的血清中( pH 6.6～6.8)，经37℃孵育，易溶血。此法较敏感。如血清经56℃加热30分钟，使补体灭活，患者红细胞即不溶解。
【试剂】
0.2mol/L HCl。
【操作】
1.脱纤维血的制备 取患者和同血型正常人(对照)静脉血约5ml，取下针头，慢慢地注入一事先放有几个清洁小玻璃珠的小烧瓶内。立即轻轻地、不断地摇动，直至纤维蛋白出现并附着于玻璃珠上时为止。然后将此脱纤维血倒入试管中，离心沉淀，分离血清和红细胞。血清应及早使用，不可久储。
2.50%洗涤红细胞配制 将脱纤维血倒于一离心管中，加新鲜生理盐水至将满，颠倒混匀。离心沉淀后，尽量吸弃上清液，留下红细胞。再加生理盐水至将满，混匀，离心沉淀，如此共洗三次。最后取此压缩红细胞，加入等量生理盐水，即为50%红细胞悬液。
3.取试管6支，按表1-3-9先加入同血型正常人新鲜血清0.5ml，其中3、6两管在56℃水浴中，放30分钟，使补体灭活，其余4管放在室温中，此后按表1-3-9顺序操作。
表1-3-9 酸化血清试验操作
【结果判定】
正常人全部不溶血，PNH患者第1 管(未酸化的血清)通常不溶血或极轻微溶血;第2管则部分溶血;如第3管(加正常人灭活血清管)也溶血，则表明此溶血不依赖补体，故不是PNH，可能是红细胞有其他缺陷，如球红细胞增多症等，应作进一步鉴别。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
阳性主要见于PNH患者。伴有缺铁的患者有时可呈假阴性，但经铁剂治疗纠正后又可出现阳性。某些AIHA发作严重时也可阳性。
【注意事项】
1.一切用具要干燥，避免溶血。
2.脱纤维血制备时，通常约需旋转摇动玻璃珠10～15分钟，此时应注意摇动要轻，切勿造成溶血。
3.血清酸化后用塞盖好，避免CO 2逸出而降低血清的酸度，导致溶血程度减低。
(二)蔗糖溶血试验 【原理】
蔗糖溶液离子浓度低，经温育后可促进补体与红细胞膜的结合，使对补体敏感的红细胞膜上形成小孔，蔗糖水进入红细胞内引起红细胞膜破裂，发生溶血。
【试剂】
1.10%蔗糖溶液。
2.与患者同血型的或AB型的健康人新鲜血清。
3.患者50%红细胞悬液 取患者抗凝血经生理盐水洗涤3次后用0.85%氯化钠溶液配成。
4.生理盐水。
【操作】
1.取与患者相同血型的或AB型的健康人新鲜血清0.05ml，加10%蔗糖溶液0.85ml，混匀。
2.加患者50%红细胞悬液0.1ml，混匀。
3.置37℃水浴箱中30分钟，取出以1000r/min离心5分钟，再观察上清液有无溶血现象。
【结果判定】
浅红色或红色为阳性，无色为阴性。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
蔗糖溶血试验阳性见于PNH。部分自身免疫溶血性贫血、巨幼细胞贫血和遗传性球形红细胞增多症呈弱阳性。
【注意事项】
1.所用器材应清洁干燥，以免溶血造成假阳性。
2.每次实验应同时作正常对照。
(三)蛇毒因子溶血试验 【原理】
蛇毒因子是从眼镜蛇毒中提取的一种分子质量为144 000的蛋白质，它能直接激活血清中的补体C3，通过旁路途径激活补体系统，进攻PNH患者红细胞，造成溶血。
【试剂】 1.蛇毒因子
用生理盐水配成0.1mg/ml。
2. AB血清
取新鲜或－80℃保存的AB血清。
3. PNH样红细胞( PNH like cell)
取正常人的红细胞，生理盐水洗3次，3000r/min离心后，用生理盐水作1∶5稀释。取悬液1ml，加入8mmol/L马来酰亚胺( NEM) 1ml，置于37℃温育60分钟，用生理盐水洗3次，配成2%的红细胞悬液。
【操作】
1.患者及正常人(阴性对照)血均用枸橼酸钠抗凝。阳性对照是PNH like cell。
2.患者及正常人标本用生理盐水洗3次，配成2%的红细胞悬液。
3.取3个试管按表1-3-10操作。
表1-3-10 蛇毒因子溶血试验操作表
4.上述各管以1500r/min离心5分钟，取上清液在415nm比色测定吸光度。
【结果计算】
【结果判定】
溶血度大于10为阳性;溶血度小于5为阴性。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
PNH呈阳性。
【注意事项】
1.对照管的吸光度应控制在0.05左右，若大于0.10，应重做。
2.只有阳性对照大于10%，阴性对照小于5%本实验结果才有意义。
六、免疫性溶血性贫血检验
(一)单特异性抗球蛋白试验 【原理】
抗球蛋白试验又称Coombs试验。直接法利用单价抗人球蛋白血清与已被不完全抗体或补体致敏红细胞产生凝集反应，可检查红细胞是否已被某种不完全抗体所致敏。间接法则是一种探知血清中存在不完全抗体或补体的方法，在免疫性溶血病诊断中采用致敏红细胞测定受检血清相应的不完全抗体及其类型。
【试剂】 1.抗IgG
与IgG (抗D)致敏细胞凝集效价≥1∶4。
2.抗C3d
与C 3致敏细胞凝集效价≥1∶4。
3.抗IgG + C3d
凝集效价≥1∶4。
【操作】 1.直接法
( 1)抽取静脉血，以枸橼酸钠抗凝为宜。
( 2)用生理盐水洗涤待测红细胞3次，配成5%的红细胞悬液。
( 3)取3支小试管，分别加入50μl受检红细胞悬液。标明抗IgG、抗C 3d以及抗IgG + C 3d。
( 4)每管中分别加入相应的3种抗血清50μl，1000r/min离心5分钟，观察凝集结果。
2.间接法
( 1)及时分离受检血清。
( 2)将正常O型( RhD + )红细胞洗涤3次，配成5%的O型红细胞悬液。
( 3)取1支小试管，加入受检血清500μl和O型红细胞悬液500μl，混匀后，加塞，置37℃水浴箱温浴1小时。
( 4)取出2000r/min离心5分钟，弃去上清液;将红细胞轻轻混匀(可能被致敏)，以生理盐水洗涤3次后，尽量弃去上清液。
( 5)以生理盐水重悬为5%的红细胞悬液，分别取50μl加入3支小试管中。标明抗IgG、抗C 3d以及抗IgG + C 3d。
( 6)每管中分别加入相应的3种抗血清50μl。
( 7)以1000r/min离心5分钟，轻轻摇动，观察凝集现象。
【结果判定】 1.阳性
见红细胞凝集，几乎没有或有少量散在红细胞。
2.弱阳性
见有少量红细胞凝集，大部分为散在红细胞。
3.阴性
未见凝集，全为散在红细胞。
【参考区间】
直接法和间接法均阴性。
【临床意义】
1.自身免疫性溶血性贫血( autoimmune hemolytic anemia，AIHA)患者直接法阳性，间接法少数阳性。阳性还见于同种免疫性溶血性贫血、药物诱导的溶血性贫血和其他疾病如SLE、类风湿关节炎、多发性骨髓瘤、镰状细胞病、器官移植、淋巴增殖病、恶性肿瘤等。
2.应注意混合型AIHA，可能是温抗体( IgG)和冷抗体( IgM)同时存在，可应用冷凝集素和冷热凝集素试验协助诊断。
3.间接法主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测。当间接法阳性、直接法阴性时，应结合病史，考虑同种免疫性溶血性贫血。
4.多特异性(广谱) Coombs试验见本篇第五章第四节。利用单特异性Coombs试验不但能进行分型试验，且比经典Coombs试验敏感。
【注意事项】
1.每批新的试剂要进行性能验证。试剂开启后需在规定条件下保存和使用。每次试验宜用正常O型红细胞作阴性对照、阳性血清致敏O型红细胞作阳性对照。
2.标本采集要顺利，不能出现凝集现象;应尽快送检，放置过程中可使抗体从细胞表面丢失或结合上非特异性补体，造成假阴性或假阳性结果。当体内有冷凝集抗体时，会影响直接法抗人球蛋白试验的结果判读。
3.观察红细胞凝集时，动作应轻柔，切忌用力过猛。红细胞凝集程度很弱时，应在显微镜下观察。
(二)冷凝集素试验 【原理】
冷凝集素综合征的患者血清中存在冷凝集素，为IgM类完全抗体，在低温时可使自身(或O型、同型)红细胞发生凝集。凝集反应的高峰在0～4℃，当温度回升到37℃时凝集消失。
【试剂】
生理盐水。
【操作】
1.取患者静脉血2ml，置37℃温箱中，凝固后分离血清。
2.取患者(或同型、O型正常人)抗凝血1～2ml，以温生理盐水洗涤红细胞3次，最后配成2%红细胞悬液。
3.取10支小试管，每管加生理盐水0.2ml，第1管加血清0.2ml，逐管倍比稀释至第9管，混匀后弃去0.2ml。第10管作对照。
4.每管加2%红细胞悬液0.2ml (由此形成1∶4～1∶1024系列血清滴度)，摇匀，置4℃冰箱中2～4小时。
【结果判定】
观察各管凝集现象，记录有明显凝集的最后一管的滴度。如第9管仍凝集，宜继续稀释观察其最高滴度。
【参考区间】
冷凝集素滴度＜1∶16。
【临床意义】
阳性见于冷凝集素综合征(＞1∶1000)。支原体肺炎、传染性单核细胞增多症、疟疾、肝硬化、淋巴瘤及多发性骨髓瘤患者亦可增高，但多数患者不超过1∶1000。抗体几乎均为IgM，但也有报告IgG或IgA增高，故广谱抗球蛋白直接反应可呈阳性。某些AIHA患者冷凝集素效价很高，有的可达1∶64 000以上。
【注意事项】
除观察凝集外，同时要注意溶血现象，如发现溶血，应同时报告。
(三)冷热溶血试验 【原理】
冷热溶血试验又称D-L试验( Donath-Landsteiner test)。阵发性冷性血红蛋白尿症( PCH)患者血清中有一种特殊的冷-热反应抗体( Donath-Landsteiner抗体)，在20℃以下(常为0～4℃)时与红细胞结合，同时吸附补体，但不溶血。当温度升至37℃时，补体激活，使红细胞膜破坏而发生急性血管内溶血。
【操作】
1.取血约3ml，加到3支已预温至37℃的小试管中，每管约1ml，分别标记为A、B、C。
2. A管凝固后静置于37℃1小时，B管凝固后置4℃1小时，C管则先置于4℃中30分钟，再置于37℃1小时，各管均不可搅动。
【结果判定】
如仅C管溶血，A、B管不溶血，结果为阳性，表明患者可能有Donath-Landsteiner抗体。
【参考区间】
阴性。
【临床意义】
阳性对阵发性寒冷性血红蛋白尿的诊断有一定价值，D-L抗体效价可高于1∶40。某些病毒感染:如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、传染性单核细胞增多症也可见阳性反应。
【注意事项】
1.如患者近期正溶血发作，由于补体被消耗，可得出假阴性结果。
2.此种冷抗体应与由IgM引起的冷凝集素区别。后者在体外pH 6.9～7.0时亦可缓慢地溶血，患者血清中冷溶血抗体滴度一般不高，血清中的补体由于消耗而降低。
3.在急性发作期，患者红细胞用抗补体直接抗球蛋白试验，常呈阳性。