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第一节 常见检测项目
一、血液恶性肿瘤免疫表型分析
【原理】 1.分析原理
根据不同类型不同时期的血液恶性肿瘤其肿瘤细胞出现的抗原时序混乱表达、抗原跨系表达及分化阻滞等现象，通过流式细胞术免疫荧光染色法，比较分析分化抗原在肿瘤细胞和正常造血细胞上的表达有何不同，是否出现过度表达、缺失表达、不规则表达或非生理性表达等，从而对血液恶性肿瘤进行诊断、分型及预后判断，并为选择治疗方案提供重要依据。
2.设门法原理
CD45/侧向角散射光( side scatter，SSC)设门法是目前血液恶性肿瘤免疫表型分析常用的数据采集和分析策略。CD45是白细胞的共同抗原，成熟红细胞和血小板不表达。CD45在白细胞上表达的荧光强度与细胞分化程度有一定关系，即分化程度高的成熟白细胞CD45的荧光强度也高，分化程度低的原始细胞荧光强度也低;而在成熟白细胞中，各类细胞CD45的荧光强度亦不相同，其中淋巴细胞和单核细胞的荧光强度高于中性粒细胞。因此，根据各类造血细胞上CD45表达的荧光强度和颗粒密度不同，采用CD45/SSC设门法可以将原始细胞(低荧光强度，低或高SSC)、淋巴细胞(高荧光强度，低SSC)、单核细胞(高荧光强度，中等SSC)、幼稚及成熟粒细胞(低荧光强度，高SSC)、红系细胞(最低荧光强度，低或高SSC)和细胞碎片(最低荧光强度，最低SSC)清楚地区分开，见图1-6-1。通过准确设门后，分析靶细胞群中各种分化抗原的表达情况。
图1-6-1 骨髓中各类细胞在CD45 SSC散点图中的分布
A门:淋巴细胞; B门:单核细胞; C门:幼稚及成熟粒细胞; D门:原始细胞; E门:红细胞及细胞碎片
3.分化抗原
分化抗原是造血细胞在分化成熟过程中，不同系列、不同分化阶段及活化过程中出现或消失的细胞表面标志。人类白细胞分化抗原( human leucocyte differentiation antigen，HLDA)工作组对人类白细胞分化抗原进行整理编号，依据以单克隆抗体鉴定为主的聚类分类法，将抗体识别的同一种分化抗原归为同一个分化群，即CD。CD主要按其分布的细胞群分类，分为T细胞、B细胞、NK细胞、髓细胞/单核细胞、血小板、黏附分子、内皮细胞、细胞因子受体、树突状细胞、干/祖细胞、红细胞和活化抗原12类标志，以下为造血细胞各系列不同分化阶段的主要标志。
( 1)造血干/组细胞:
①造血干细胞( hematopoietic stem cell，HSC) : CD34;②定向祖细胞: CD34、人类组织相容性抗原-DR ( HLA-DR )、CD38;③髓系祖细胞: CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33 (弱表达)、髓性过氧化物酶( myeloperoxidase，MPO) ;④B系祖细胞: CD34、CD38、HLA-DR、末端脱氧核糖核苷酸转移酶( terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)、CD19、CD10;⑤T系祖细胞: TdT、胞质( cytoplasm，c) CD3、CD7。
( 2) T细胞系:
cCD3或CD3、CD1a、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、TdT、CD34、CD99、T细胞受体( T cell receptors，TCR)αβ、TCRγδ;其中，cCD3、CD2、CD5、CD7表达于各阶段T细胞; TdT、CD34、CD99表达于原始T细胞; CD1a、CD4、CD8表达于胸腺皮质阶段T细胞;成熟T细胞CD4亚群表达CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRαβ; CD8亚群表达CD2、CD3、CD5、CD7、CD8、TCRαβ。
( 3) B细胞系:
cCD22或CD22、CD19、cCD79a、TdT、CD34、CD10、CD20、免疫球蛋白轻链kappa、免疫球蛋白轻链lambda;其中，cCD22或CD22、CD19、cCD79a表达于各阶段B细胞; TdT、CD34、CD10表达于原始B细胞: CD20表达于幼稚和成熟B细胞; kappa或者lambda表达于成熟B细胞。
( 4)粒系:
MPO、CD33、CD13、CD34、HLADR、CD117、CD64、CD15、CDw65、CD11b、CD16。MPO是粒系相对特异的标志; CD33、CD13表达于粒系各阶段细胞; CD34和HLA-DR表达于原粒细胞; CD117在中幼粒细胞及其以后阶段不表达; CD15在早幼粒细胞开始出现，在以后各阶段的成熟粒细胞上强表达; CD11b表达于中幼粒细胞以后阶段的各类髓系细胞; CD16、CD10表达于成熟粒细胞。
( 5)单核系:
HLA-DR、CD33、CD13、CD64、CDw65、CD11b、CD11c、CD15、CD36、CD14、CD68、CD4;其中，HLA-DR、CD33、CD13表达于单核系各阶段细胞，CD64、CDw65、CD11b、CD11c、CD15、CD36在幼单核阶段开始表达; CD14、CD4表达于成熟单核细胞和巨噬细胞。
( 6)红系:
CD117、CD71、CD36、血型糖蛋白A ( glycophorin A，GlyA，CD235a)及血型抗原;其中，CD117见于原红和早幼红阶段; CD71表达于造血祖细胞向红系分化及以后各阶段;血型糖蛋白A和血型抗原表达于早幼红细胞及以后各阶段。
( 7)巨核系:
CD41、CD42、CD61、CD36、CD9。
4.急性白血病初筛建议方案
CD45用于CD45/ SSC设门法确定异常细胞群，要求每一测试管均加入同一荧光素标记的CD45。cCD3和(或) CD3、CD2、CD5、CD7、cCD22或cCD79a、CD19、CD10是淋系标志，其中，cCD3和(或) CD3、CD2和CD7是T细胞系标志，cCD3和(或) CD3是T细胞系特异性标志; cCD22或cCD79a、CD19是B细胞系标志，cCD22或cCD79a是B细胞系特异性标志。MPO、CD13、CD33、CD14是髓系标志，其中，MPO是髓系特异性标志，CD14对单核细胞系更特异; CD41是巨核细胞系标志; GlyA是红系标志; CD34、HLA-DR是非系列特异性标志。
不排除跨系表达，如髓系白血病或B系白血病可出现CD7阳性，T系白血病可出现CD13阳性等。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的单克隆抗体。
2.红细胞裂解液。
3.破膜用固定剂。
4.破膜剂。
5. pH 7.4的PBS。
6.荧光标准微球。
7.质控物。
8.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
9.蒸馏水。
10.多聚甲醛1%。
11.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
肝素抗凝的新鲜骨髓液2ml及以上，或EDTA抗凝的新鲜外周静脉血2ml及以上。血液恶性肿瘤免疫表型分析以骨髓作为首选标本，不排除组织和体液标本，不推荐使用枸橼酸钠抗凝，标本应在48小时内进行免疫荧光染色。
2.细胞计数
计数有核细胞数量，取100μl含1×10 6有核细胞的细胞悬液加入流式细胞术专用试管。
( 1)细胞免疫荧光染色
1)细胞膜免疫荧光染色:①每管加入适量(如10～20μl)荧光素标记的单克隆抗体或对照试剂(依据操作说明书)，室温避光孵育20～30分钟;②加入适量(如2ml)的1×红细胞裂解液(依据操作说明书)，室温避光孵育10分钟，300×g离心5分钟，弃上清;③加入2ml的PBS，200×g离心5分钟，弃上清;④加入500μl的PBS，避光，于4小时内进行流式细胞仪检测;或加1%多聚甲醛500μl 于4℃避光保存，48小时内检测。
2)细胞内免疫荧光染色:用于细胞内抗原染色。①含有有核细胞的测试管内加入适量(如2ml) 的1×红细胞裂解液(依据操作说明书)，室温避光孵育10分钟，300×g离心5分钟，弃上清;②加入2ml的PBS，200×g离心5分钟，弃上清;③加入适量(如0.5～1ml)破膜用固定剂(依据操作说明书)，混匀，室温孵育20～30分钟;④加入1ml的PBS，200×g离心5分钟，弃上清;⑤加入适量(如0.5～1ml)破膜剂(依据操作说明书)，混匀，室温孵育20～30分钟;⑥加入1ml的PBS，400×g离心5分钟，弃上清，混匀;⑦加入适量(如10～20μl)荧光素标记的单克隆抗体(依据操作说明书)，室温避光孵育15～30分钟;⑧加入1ml的PBS，400×g离心5分钟，弃上清;⑨加入0.5～1ml的PBS，混匀，于4小时内进行流式细胞仪检测。
3)细胞膜和细胞内联合免疫荧光染色:用于细胞表面抗原和细胞内抗原的联合染色。①含有有核细胞的测试管内加入适量(如10～20μl)荧光素标记的单克隆抗体或对照试剂(依据操作说明书)，室温避光孵育20～30分钟;②加入适量(如2ml)的1×红细胞裂解液(依据操作说明书)，室温避光孵育10分钟，300×g离心5分钟，弃上清;③加入2ml的PBS，200×g离心5分钟，弃上清;④加入适量(如0.5～1ml)破膜用固定剂(依据操作说明书)，混匀，室温孵育20～30分钟;⑤加入1ml的PBS，200×g离心5分钟，弃上清;⑥加入适量(如0.5～1ml)破膜剂(依据操作说明书)，混匀，室温孵育20～30分钟;⑦加入1ml的PBS，400×g离心5分钟，弃上清，混匀;⑧加入适量(如10～20μl)荧光素标记的单克隆抗体(依据操作说明书)，室温避光孵育15～30分钟;⑨加入1ml的PBS，400×g离心5分钟，弃上清;⑩加入0.5～1ml的PBS，混匀，于4小时内进行流式细胞仪检测。
( 2)流式细胞仪测定
1)开机前准备:灌满鞘液桶，清空废液桶。
2)开机:根据仪器说明书进行开机。
3)光路校准:采用荧光标准微球进行仪器光路校准，使各检测通道的变异达到操作说明书要求，如CV值＜2.0%。
4)建立分型方案:在流式细胞仪上建立免疫表型分析检测方案并保存，前向散射光( FSC)信号通常采用线性参数收集数据，SSC和荧光信号通常采用对数参数收集数据。
5)上样:细胞获取速度为每秒200～400个细胞。
6)调节各检测通道电压至合适的检测条件。
7)调整荧光补偿:推荐采用标记除待测通道外其他所有通道荧光标志的荧光缺一( fluorescence minus one，FMO)对照，配合仪器自动补偿，也可以采用手工补偿。
8)获取细胞:获取细胞量通常在10 000～20 000个，对于抗原表达较少的靶细胞，至少收集2000～3000个待测靶细胞才能保证结果的可靠性。
9)设门:通常采用CD45/SSC设门法进行第一步设门，确定分析靶细胞群，同时去除细胞碎片和细胞聚集体对实验的干扰;再通过其他荧光散点图或直方图，分析靶细胞群表达一种或以上标志抗原的百分率和荧光强度，也可以分析两种及以上标志抗原共表达情况。
10)保存数据，并根据仪器说明书进行仪器清洗和关机。
( 3)报告内容:
至少包括以下内容。
1)标本中异常细胞百分比。
2)异常细胞的免疫表型分析:单一分化抗原的表达百分率和表达强度，相关抗原共表达和单一表达的百分率和表达强度。
3)提供抗原异常表达的典型图形，包括第一步设门图。
4)必要的文字说明。
5)标本有质量问题需注明。
【结果判定】 1.白血病分型诊断 ( 1) WHO2008白血病系列划分标准
1) T系: cCD3或CD3阳性。
2) B系: CD19强表达伴cCD79a、cCD22、CD10至少一个强表达，或CD19弱表达伴cCD79a、cCD22、CD10至少两个强表达。
3)髓系: MPO阳性;或单核系分化抗原，包括非特异性酯酶染色、CD11c、CD14、CD64及溶菌酶中至少有2项为阳性。
( 2) EGIL1998和WHO2001白血病积分系统:
见表1-6-1。
表1-6-1 EGIL1998和WHO2001白血病评分标准
备注:当每个系列积分＞2分时，则诊断为混合表型急性白血病
2.前体B淋巴细胞肿瘤 ( 1) B原淋巴细胞白血病/淋巴瘤( B-acute lymphoblastic leukemia/lymphoma，B-ALL/LBL) :
原 淋巴细胞强表达B系抗原CD19、cCD22、cCD79a，CD22 或cCD22特异性较好;常表达HLA-DR和CD10;可表达CD22、CD24和TdT; CD20和CD34的表达变异较大;可伴髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD11b表达;少数伴T系抗原CD2、CD5表达。
( 2)早期前B-ALL ( pro B-ALL) :
白血病细胞群的CD19、CD34及TdT阳性，CD10、cIg及SmIg为阴性，相当于FAB的L1和L2。
( 3)普通型ALL ( common B-ALL) :
白血病细胞群的CD19、CD34、TdT及CD10阳性，cIg及SmIg为阴性，相当于FAB的L1和L2。
( 4)前B-ALL ( pre B-ALL) :
白血病细胞群的CD19、TdT、CD10及cIg阳性，SmIg阴性，相当于FAB的L1。
( 5)成熟B-ALL:
白血病细胞群的CD19和SmIg阳性，CD34、TdT及CD10阴性，相当于FAB 的L3。
3.前体T淋巴细胞肿瘤 ( 1) T-原淋巴细胞白血病/淋巴瘤( T-ALL/ LBL) :
原淋巴细胞通常表达TdT;常表达cCD3或 CD3、CD7;可表达CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10; CD4和CD8共表达多见于T-幼淋 巴细胞淋巴瘤。
( 2)早前期T-ALL ( Pro T-ALL) :
白血病细胞群的TdT阳性，cCD3阳性，CD7阳性，CD3阴性，CD2阴性，CD1a阴性，CD4和CD8呈双阴性，相当于FAB的L1和L2。
( 3)前T-ALL ( Pre T-ALL) :
白血病细胞群的TdT阳性，cCD3阳性，CD7阳性，CD3阳性和(或) CD2阳性和(或) CD1a阳性和(或) CD5阳性，但CD4阴性，相当于FAB的L1和L2。
( 4)皮质T-ALL:
白血病细胞群的TdT阳性，cCD3阳性，CD7阳性，CD3阳性，CD1a阳性，CD2阳性和(或) CD5阳性，CD4和CD8为双阳性表达，相当于FAB的L1和L2。
( 5)成熟T-ALL:
白血病细胞群的TdT阴性，cCD3阳性，CD7阳性，CD3阳性，CD2阳性和(或) CD5阳性，CD1a阴性，CD4或CD8阳性，但不呈现双阳性表达，相当于FAB的L1和L。
4.急性髓系白血病和相关前体细胞肿瘤 ( 1)微分化型急性髓系白血病:
白血病细胞表达干/祖细胞抗原，如CD34、HLA-DR、TdT等;至少表达1个早期髓系抗原，如CD117、CD13和(或) CD33，MPO可以阳性，但细胞化学染色MPO为阴性;不表达髓系成熟抗原，如CD15、CD11b、CD14、CD64等;不表达特异性淋系抗原，如cCD3、cCD79a、cCD22等，但CD7可阳性。相当于FAB分型的AML-M0 ( minimally differentiated acute myeloid leukemia)。
( 2)未成熟型急性髓系白血病:
白血病细胞至少表达2个及以上髓系抗原，如CD13、CD33、CD117等;通常不表达成熟粒系抗原如CD15、CD65，或单核系抗原如CD14、CD64; CD34、HLADR多阳性; CD11b亦可阳性; MPO部分阳性;不表达特异性淋系抗原，如cCD3、cCD79a、cCD22等，但CD7可阳性。相当于FAB分型的AML-M1 ( acute myeloid leukemia without maturation)。
( 3)成熟型急性髓系白血病:
白血病细胞常表达干/祖细胞抗原，如CD34、HLA-DR;表达髓系抗原，如CD117、CD13和(或) CD33;表达粒系成熟抗原，如CD15、CD11b、CD65等;一般不表达单核系抗原，如CD14、CD64; CD7可阳性。伴t ( 8; 21) ( q22; q22) ; RUNX1-RUNX1T1的AML，可弱表达CD19、cCD79a，CD56阳性提示预后不良。相当于FAB分型的AML-M2 ( acute myeloid leukemia with maturation)。
( 4)急性早幼粒细胞白血病伴t ( 15; 17) ( q22; q12) ; PML-RARA:
白血病细胞低表达或不表达HLA-DR、CD34、CD11b、CD11c;强表达CD33和MPO; CD13呈异质性表达;可表达CD117、CD 64、CD9; CD15、CD65常阴性或弱表达; CD56阳性者多呈现遗传学变异，并提示预后不良。相当于FAB分型的AML-M3 ( acute promyelocytic leukemia，APL)。
( 5)急性粒-单核细胞白血病:
CD45/SSC散点图可见三群异常细胞，第一群位于原始细胞区( SSC较小，CD45弱表达) :表达干/祖细胞抗原HLADR、CD34;表达髓系抗原CD117、CD13、CD33;部分表达CD7。第二群位于单核细胞区( CD45表达较强) :表达单核系及其他髓系抗原，如CD14、CD64、CD11b、CD11c、CD36;表达巨噬细胞限制性抗原CD68、CD163，CD15弱表达和CD64强表达提示单核系分化;第三群位于分化的粒细胞区( SSC较大，CD45弱表达) :表达髓系抗原CD11b、CD13、CD15、CD33，部分表达CD16。三群可能集中界限不清。相当于FAB分型的AML-M4 ( acute myelomonocytic leukemia，AMML)。
( 6)急性原单核细胞和单核细胞白血病:
白血病细胞至少表达2种单核系抗原，如CD4、CD14、CD64、CD11b、CD11c、CD68、CD36等;表达髓系抗原，如CD13、CD15、CD33、CD65等; CD34和CD117可阳性;几乎所有患者均表达HLA-DR。相当于FAB分型的AML-M5 ( acute monocytic leukemia，AMoL)。
( 7)急性红白血病:
红白血病和纯红白血病的免疫表型不同。红白血病时，红系前体细胞可表达HbA和GlyA，CD71可低表达;不表达CD45和髓系抗原，MPO阴性; HbA和GlyA阴性者提示红系前体细胞早期阶段; CD36常阳性;髓系幼稚细胞可不同程度地表达MPO、CD13、CD33、CD64、CD11c、CD117、CD34、HLA-DR。纯红白血病时，异常细胞可表达GlyA、CD71、CD36，不表达CD45、MPO和其他髓系抗原，但CD117常阳性; HLA-DR和CD34常阴性;如CD71或CD36阳性而GlyA阴性，提示红系早期分化。相当于FAB分型的AML-M6 ( erythroleukemia，EL)。
( 8)急性巨核细胞白血病:
白血病细胞至少表达2种血小板膜糖蛋白标志，如CD41、CD61、CD36等，胞质抗原比膜表面抗原阳性更特异;成熟抗原CD42b可不表达;髓系抗原CD13、CD33、CD117可阳性; CD45、CD34和HLA-DR通常为阴性;原巨核细胞通常不表达MPO，不表达淋系抗原和TdT，但CD7可阳性。相当于FAB分型的AML-M7 ( acute megakaryoblastic leukemia，AMeL)。
5.混合表型急性白血病( mixed phenotype acute leukaemia，MPAL)
MPAL通常表现为双表型和双克隆型。双表型为一种白血病细胞同时表达2个或2个以上系列标志。双克隆型为同时存在2种或2种以上异常细胞，分别表达各自的系列特异性标志。MPAL常见类型: T细胞系/髓系、B细胞系/髓系、T细胞系/B细胞系、T细胞系/B细胞系/髓系。诊断标准参考表1-6-1。
6.成熟淋巴细胞肿瘤 ( 1) B-慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤( B-CLL/SLL) :
成熟淋巴细胞群主要表达B系抗原，如CD19、CD20、CD22、CD23、cCD79a等，常共表达CD5;一般不表达CD10和FMC7;表达CD38和ZAP-70者提示预后不良。
( 2)浆细胞骨髓瘤:
肿瘤细胞群弱表达或不表达CD45;强表达CD38;可表达CD138、CD56、CD20、胞质( c) lambda或kappa; CD19常阴性; CD22、HLA-DR和CD34少见表达。
( 3)毛细胞白血病( HCL) :
肿瘤细胞群强表达CD20、CD22、CD11c及限制性膜免疫球蛋白轻链;表达CD103、CD25、FMC7; CD10和CD5通常阴性。
( 4)滤泡淋巴瘤:
肿瘤细胞表达膜表面免疫球蛋白，呈轻链限制性;表达B系相关抗原，如CD22、CD20、CD19、cCD79a等;可表达CD10，不表达CD5、CD43; CD21、CD23表达不一。
( 5) Burkitt样淋巴瘤/白血病:
肿瘤细胞上膜IgM和kappa或者lambda轻链呈中等或强表达;表达B细胞相关抗原，如CD19、CD20、CD22、CD10、cCD79a等;表达CD38; TdT和CD34常阴性。
( 6)成熟T细胞淋巴瘤:
异常淋巴细胞群出现异常T细胞表型，如CD3、CD5、CD7表达下调;出现CD4阳性/CD8阴性表型或CD4/CD8双阳性或CD4/CD8双阴性;可表达CD8、CD56、TCRαβ、CD30、CD15等;不表达幼稚淋巴细胞抗原，如CD34、TdT和CD1a等。
( 7) NK细胞淋巴瘤:
异常淋巴细胞群上正常NK细胞的抗原表达减弱或丢失，如CD16、CD56、CD7、CD94、CD161等;出现CD8一致性表达;可表达CD5。
7.骨髓增殖性肿瘤 ( 1)慢性髓细胞白血病-慢性期( chronic myeloid leukemia-chronic phase，CML-CP)
1)原始细胞比例不高，表达CD34、CD117、CD13、CD33、HLA-DR;部分表达CD2、CD7、CD19、CD56等。
2)幼稚中性粒细胞及以下各阶段细胞比例明显升高。
3)各发育阶段粒细胞发育模式改变: CD16阴性CD11b阴性、CD16阴性CD11b阳性阶段细胞偏多。
4)粒细胞异常表达:异常表达CD56、CD15。
5)可见明显的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞群，嗜酸性粒细胞表达MPO、CD15、CD13、CD64、CD33、CD9，不表达CD16;嗜碱性粒细胞表达CD9、CD13、CD33、CD36，弱表达CD22、CD25;强表达CD38、CD123;不表达 CD19、CD34、CD64、HLA-DR。
( 2)骨髓增生异常综合征( myelodysplastic syndrome，MDS)
1) CD34阳性的髓系祖细胞增多，表达CD11b 和(或) CD15，不表达CD13、CD33或HLA-DR，CD45表达下降，CD38表达异常下降，表达淋系抗原CD7、CD56等，可出现CD34阳性CD10阳性共表达。
2)各个成熟阶段的粒细胞和单核细胞出现抗原表达改变，包括丢失、增强、减弱，可出现伴系表达。
3)髓系发育异常，可出现CD16阳性CD11c阳性CD64弱阳性的成熟阶段细胞比例减低，CD16阴性CD11b阳性的中间阶段细胞增多和(或) CD11b阴性CD13阳性的早期阶段细胞增多，或者CD64强表达CD11c阴性的早中期阶段细胞增多，SSC减低提示粒细胞脱颗粒。
4)单核细胞可能出现CD13、CD14、CD16或CD33表达缺失，CD34阳性，伴淋系抗原表达，但CD4阴性。
5)红系前体细胞可能出现CD45表达异常，表达CD34，CD71、CD117和CD352a异常表达。
6)可能出现巨核细胞比例增多及抗原表达异常。
( 3)慢性粒-单核细胞白血病( chronic myelomonocytic leukemia，CMML)
1)外周血和骨髓中成熟单核细胞增多，强表达CD45，表达CD14、CD64、CD11b、CD11c、HLA-DR、CD33、CD13、CD36等，弱表达CD4、CD15等。
2)外周血中髓系原始细胞增多，表达CD34、CD117、HLA-DR;部分病例异常表达CD7、CD56;亦可出现CD13、CD33、CD117表达减低或缺失。
3)单核细胞可能不表达CD14，可能伴有CD56异常表达，或者其他单核细胞抗原表达强度异常。
4)在CD45/SSC散点图上，CD45弱表达/SSC大的分化粒细胞可能减少，CD16阳性和(或) CD16阴性CD11b阳性的成熟和较成熟阶段的粒细胞减少，或者阶段性缺乏，异常表达CD56、CD34、HLA-DR等，髓系抗原CD13、CD33、CD15、CD16、CD11b、CD11c、CD64、MPO可能出现表达强度异常。
5)有核红细胞可能增多，尤其在外周血，部分出现CD71表达强度减低。
【临床意义】
1.免疫表型分析已被纳入白血病WHO分型方案中，是诊断和鉴别诊断白血病、淋巴瘤及血液恶性肿瘤，选择化疗方案和判断预后的重要实验室指标，通常用于ALL分型、鉴别AML与ALL及确定形态学不能或很难区分的白血病类型及亚型。
2.免疫表型分析补充了形态学的不足，提高了分型的准确性;同时，免疫表型分析需结合形态学分型及遗传学分析等，以提高对异质性和非同步性抗原表达紊乱的白血病细胞的鉴别能力。
3.急性淋巴细胞白血病免疫表型分析用于诊断和鉴别诊断T系和B系白血病。急性髓系白血病免疫表型分析为诊断和鉴别诊断提供重要参考信息，但不作为分型唯一依据。对于微分化型急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病的鉴别，免疫表型分析是重要诊断项目。
4. MDS免疫表型分析是诊断MDS的辅助标准，用于分析骨髓细胞表型是否异常，红系和(或)髓系是否存在单克隆细胞群。
【注意事项】
1.各种血液恶性肿瘤免疫表型分析的判定不能涵盖所有患者，这与肿瘤细胞表型的高异质性有关。
2.尽管CD45/SSC设门法可以清楚地区分原始细胞、各系列成熟细胞及细胞碎片等，从而准确定位靶细胞群，克服了前向角散射光( FSC) /SSC设门法受成熟细胞或其他细胞干扰的缺点;但并非所有靶细胞的定位均采用CD45/SSC设门法，例如，定位浆细胞骨髓瘤细胞，也可采用CD38/SSC设门法或CD45/CD138设门法，其设门优势更突出。
3. cCD3、cCD22和MPO分别对T系、B系和髓系特异和敏感，通过这些抗原可以对大多数病例作出初步的系列分型判断;但如果cCD3、cCD22和MPO均为阴性，必须检出2个及以上同系列抗原出现异常表达，并排除其他诊断，才能作出系列分型诊断。CD7对T-ALL最敏感，但特异性差，常伴随AML表达;除cCD22外，CD19和cCD79a也是B-ALL较特异而敏感的分型标志;虽然MPO对髓系白血病特异，但只有50%～70%的AML表达MPO。针对CD45阴性或髓系和淋系抗原均阴性的肿瘤细胞，需排除红白血病、巨核细胞白血病、浆细胞肿瘤、转移癌或原始浆细胞样树突状细胞肿瘤( blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm，BPDC)等，BPDC抗原标志为BDCA-2 ( CD303 )、BDCA-4 ( CD304 )、CD4、CD56、CD123、HLA-DR等。
二、微量残留白血病检查
【原理】
根据初发白血病分型诊断，联合使用多种造血细胞相关抗原，通过流式细胞仪可以鉴定出表达白血病相关免疫表型( leukemia associated immuno phenotypes，LAIP)的微量残留白血病( minimal residual disease，MRD)细胞。LAIP是指与正常造血细胞存在质和量差异的白血病细胞分化抗原的异常表达，MRD细胞的LAIP主要表现为:正常血细胞分化成熟过程的抗原表达缺失、表达过度及非同步性表达，不同系列如淋系和髓系相关抗原及不成熟和成熟相关抗原的非生理性共表达。
建议分型方案:首先对初发患者采用4色及以上免疫荧光染色法结合流式细胞术进行MRD标志筛选，利用筛选出的有效标志进行组合来动态监测MRD。
1.急性T淋巴细胞白血病微量残留白血病( TALL MRD)
( 1)常用第一步设门: CD3/SSC。
( 2 ) LAIP: CD7、CD5、CD3、CD4、CD8、CD2、TdT、CD38、CD34等。
2.急性B淋巴细胞白血病微量残留白血病( BALL MRD)
( 1)常用第一步设门: CD19/SSC。
( 2 ) LAIP: TdT、CD10、CD19、CD34、CD22、CD21、CD13、CD33、CD15、CD38、CD45、CD58等。
3.急性髓系白血病微量残留白血病( AML MRD)
( 1)常用第一步设门: CD45/SSC。
( 2) LAIP: CD34、CD117、CD45、CD13、CD33、CD14、CD15、CD38、HLA-DR、CD56、CD7、CD19等。
【试剂与仪器】
同“血液恶性肿瘤免疫表型分析”。
【操作】
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。通过流式细胞仪测定时，设门策略参考微量残留白血病“建议分型方案”，尽可能获取有核细胞数，以超过1.0×10 6为宜。
【结果判定】 1. T-ALL MRD
与初发T-ALL相比，表面抗原变化不大; cTdT和CD34过度表达，通常cTdT与cCD3呈共表达;也可出现CD33和CD117等交叉抗原表达;出现CD7过表达，CD3低表达或不表达，CD45不表达等; CD19和HLA-DR常阴性。
2. B-ALL MRD
与初发白血病相比，通常有1个及以上表面抗原的荧光强度发生改变，呈现过表达或低表达，其中，CD34与CD10在B-ALL MRD中发生变化的频率最高;常出现正常早期B淋巴细胞中极少出现的交叉抗原表达，如CD13、CD33、CD15、CD65等;也亦出现抗原的非同步表达:如CD34和CD21的共表达。
3. AML MRD
与初诊时的LAIP大多相似。
【临床意义】
MRD是指白血病经化疗获得完全缓解后或骨髓移植治疗后，体内残留白血病细胞的状态，是白血病复发的主要根源。流式细胞术检测MRD，是预测白血病复发、判断预后、指导治疗及评价自体骨髓移植净化程度的重要手段。各种类型血液恶性肿瘤的MRD免疫表型分析，因肿瘤细胞表型的高异质性而呈现个体化现象。根据LAIP进行MRD免疫表型分析，适用于95%的ALL和70%～80%的AML患者。
【注意事项】
1.详细记录MRD监测过程中的分型方案、染色方法、流式细胞分析策略、所用试剂等重要环节，确保使用统一方案进行MRD监测，以便于结果间比较分 析。
2.在MRD监测过程中，白血病细胞抗原表达可能会发生变化而导致MRD检测结果的假阴性或假阳性。因此，初发白血病免疫表型分析结果对MRD监测具有重要参考价值。
3. MRD免疫表型分析的灵敏度取决于被分析细胞的特性及所获取的有核细胞数量，其灵敏度约为10 －3～10 －4，建议采用多色分析并尽可能收集足够量的细胞数，5色及以上多色分析可相对提高检测灵敏度。
4.结合流式细胞术白血病相关免疫表型和分子生物学技术检测的抗原受体基因重排、染色体易位及融合基因，可提高急性白血病MRD监测的灵敏度达10 －4～10 －6。
三、CD34计数
【原理】
采用荧光素标记的CD34抗体和(或)其他荧光抗体及其他荧光染料，通过流式细胞仪计数CD34的百分含量和绝对值。CD34计数包括双平台法和单平台法，前者首先由流式细胞仪测定CD34占白细胞( white blood cell，WBC)总数的百分率，再借助血细胞分析仪计数WBC，通过计算公式得出CD34绝对计数;后者利用流式细胞仪单一检测平台即可测得CD34绝对计数，其主要依据已知数量的荧光微球作为内参;以溶解红细胞免洗方法制备标本来避免细胞数丢失和体积改变;根据特异性核酸染料染色区分活细胞和死细胞;通过流式细胞仪分析CD34占有核细胞的百分比和占CD45阳性细胞的百分比;再通过计算公式得出CD34绝对数量。
目前，CD45/SSC设门法是CD34计数常用的设门策略，根据白细胞共同抗原CD45在造血干/祖细胞上的表达减弱，而在成熟的淋巴细胞、单核细胞及粒细胞上表达相对增强，在死细胞及细胞碎片上不表达等特点，通过CD45/SSC设门法将CD34阳性的干/祖细胞与其他成分区分开，以达到对干/祖细胞定位的目的。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的抗CD34抗体。
2.荧光素标记的抗CD45抗体和(或)其他抗体或荧光染料。
3.定量微球，用于单平台法计数CD34。
4.红细胞裂解液。
5. pH 7.4的PBS。
6.荧光标准微球。
7.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
8.蒸馏水。
9.多聚甲醛1%。
10.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
EDTA抗凝外周血2ml，或肝素抗凝骨髓血、脐带血、外周血干细胞采集物若干，EDTA抗凝血可室温保存12～24小时，肝素抗凝血可保存48～72小时。
2.单平台法计数CD34
参考相应的操作说明书。
3.双平台法
采用细胞膜免疫荧光染色方法。
4.设门和数据分析策略
首先采用CD45/SSC设门法设定造血干/祖细胞群，至少获取10 5～10 6个CD45阳性细胞和(或) 100个以上的CD34阳性细胞;进一步，通过在CD45/SSC散点图中设定CD45阳性细胞群;进一步，在CD34/SSC散点图中设定CD34阳性细胞;进一步，在CD45/SSC散点图中设定CD45弱阳性细胞群;进一步，在FSC/SSC散点图中设定FSC偏大的细胞群，即造血祖细胞。
5.报告
单平台法直接报告CD34细胞数/μl;双平台法报告CD34%，WBC计数(选择性报告)和CD34细胞数/μl (选择性报告) ;并进行必要的文字说明;标本有质量问题需注明。
6.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】 1.双平台法CD34计数
WBC计数(×10 9/L)× CD34% = CD34绝对值(细胞数/μl)。
2.单平台法CD34计数
(获取CD34阳性细胞数/获取定量微球数)×(每管内定量微球数/标本体积) = CD34绝对值(细胞数/μl)。
【参考区间】
健康人外周血CD34计数为0.1%～0.3%，骨髓CD34计数为1%～3%。
【临床意义】
对于有剂量要求的造血干细胞移植和骨髓移植而言，精确的造血干/祖细胞计数是确保移植成功的关键，动员后外周血CD34通常高于1%。
【注意事项】
相对于血液恶性肿瘤免疫表型，造血干/祖细胞含量较低，为能准确计数造血干/祖细胞，注意以下几点:
1.尽量简化样本处理步骤，避免溶血时间过长，以减少CD34 +细胞丢失。
2.选择对神经氨酸酶和糖蛋白酶均不敏感的Ⅲ型CD34抗体。
3.选择发射光强及非特异荧光结合少的荧光素标记的干/祖细胞抗体，如藻红蛋白( R-phycoerythrin，PE)标记的CD34抗体，也可选择藻红蛋白青色素染料5 ( phycoerythrin-Cy5，PE-CY5)和别藻蓝蛋白( allophycocyanin，APC)标记的抗体。
4.获取足够细胞数。
5.检测冻存复苏的造血干细胞采集物和脐带血标本，建议首先采用放线菌素D ( 7-aminoactinomycin D，7-AAD)评估细胞活性，并在计数干/祖细胞时同时染色7-AAD以排除死细胞的干扰，最低检测活性应在70%以上。
四、CD55、CD59和FLAER测定
【原理】
阵发性睡眠性血红蛋白尿症( paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)患者的血细胞膜出现多种糖基磷脂酰肌醇( glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定蛋白异常或缺失表达，如C3转化酶衰变加速因子( CD55)及反应性溶血膜抑制物( CD59)等，因此，采用荧光素标记的抗CD55抗体、抗CD59抗体及GPI锚定蛋白结合蛋白气单胞菌溶素( FLAER)相关标志，通过流式细胞术可以检测中性粒细胞和红细胞上CD55和CD59表达及单核细胞和中性粒细胞上FLAER表达情况。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的抗CD55抗体、CD59抗体、FLAER及其他抗体。
2.红细胞裂解液。
3. pH 7.4的PBS。
4.荧光标准微球。
5.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
6.蒸馏水。
7.多聚甲醛1%。
8.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
首选EDTA抗凝外周血，也可选择肝素钠和枸橼酸钠抗凝，标本采集后24～48小时内进行处理，不建议用骨髓标本进行PNH检测。
2.红细胞CD55和CD59计数
采用非溶血法，取全血5μl，加PBS稀释至1×10 6个红细胞/50～100μl，加入适量(如10～20μl)抗CD55和抗CD59抗体，室温避光孵育20分钟，PBS洗涤2次后，在4小时内上机检测。采用FSC/SSC散点图获取5000～10 000个红细胞。
3.中性粒细胞CD55和CD59计数及单核细胞和中性粒细胞FLAER计数
采用细胞膜免疫荧光染色方法。通常采用FSC/SSC或CD45/SSC设门;单核细胞较少时，采用抗CD14/SSC设门确定单核细胞;粒细胞较少时，采用非GPI锚定蛋白粒系标志/SSC设门法。
4.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
1.健康人外周血红细胞和中性粒细胞CD55和CD59表达完全阳性，单核细胞和中性粒细胞FLAER表达完全阳性。
2. PNH患者红细胞和中性粒细胞CD55和CD59表达出现缺失，单核细胞和中性粒细胞FLAER表达出现缺失。
3.红细胞CD55和CD59均出现缺失，具有诊断意义;否则需检测其他GPI相关抗原，如CD16、CD24或CD66。红细胞只有出现2种及以上GPI相关抗原缺失，才具有诊断意义，但不排除仅存在单一抗原缺失的PNH。
4.根据血细胞标志抗原CD55、CD59或FLAER的表达强弱，PNH细胞被分为三型:Ⅰ型(正常型)为标志抗原表达完全阳性，其荧光强度与健康人阳性峰所在荧光道数相近;Ⅱ型(部分缺陷型)为标志抗原表达部分阳性，其荧光强度处于Ⅰ型及Ⅲ型之间;Ⅲ型(完全缺陷型)为标志抗原表达完全阴性，见图1-6-2。在红细胞分析中，Ⅰ型细胞、Ⅱ型细胞和Ⅲ型细胞分辨更清楚。
图1-6-2 三型PNH细胞的流式细胞仪测定图
【临床意义】
通过分析红细胞和白细胞膜上CD55、CD59、FLAER等GPI锚蛋白缺失表达情况，可以帮助诊断PNH及鉴别其他原因引起的贫血。缺陷型PNH细胞所占比例，可以帮助判断PNH预后并反映PNH的克隆情况。
【注意事项】
1. CD55、CD59及FLAER用于PNH诊断的特异性和灵敏度均优于Coombs试验。
2. FLAER是目前检测PNH粒细胞克隆最佳指标，CD55和CD59不适用于检测PNH微小克隆细胞。
3. B细胞和网织红细胞上CD55和CD59的表达变化与红细胞和中性粒细胞基本一致，但需要联合使用B系抗原如CD19及网织红细胞染料噻唑橙( thiazole orange，TO)，增加了检测复杂性及试剂成本，不作为常规推荐。
4.淋巴细胞CD55和CD59的表达不能作为诊断PNH的指标，因为即使在健康人，淋巴细胞CD55和CD59的表达也不是完全阳性，这主要与CD8阳性T细胞和NK细胞有关。
五、血小板表面膜糖蛋白检查
(一) GPⅡb和GPⅢa测定 【原理】
GPⅡb ( CD41)和GPⅢa ( CD61)是分布于血小板膜表面的主要糖蛋白，采用荧光素标记的抗GPⅡb和抗GPⅢa抗体，通过流式细胞仪分析GPⅡb和GPⅢa的表达情况，可以帮助诊断血小板无力症( Glanzmann thrombasthenia，GT)。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的抗CD41抗体、CD61抗体及其同型对照。
2. pH 7.4的PBS。
3.荧光标准微球。
4.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
5.蒸馏水。
6.多聚甲醛1%。
7.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
枸橼酸钠抗凝静脉血3ml。
2.富含血小板血浆制备
抗凝静脉血在200g下离心5分钟，取上层血浆，PBS洗涤，取100μl含有1×10 6个血小板的细胞悬液加入试管中。
3.细胞膜免疫荧光染色
( 1)在测试管中加入适量(如20μl)的CD41 和(或) CD61抗体。
( 2)在对照管中分别加入适量(如20μl)的同型对照。
( 3)分别在测试管和对照管中加入富含血小板血浆100μl。
( 4)轻轻混匀，室温暗处孵育15～20分钟。
( 5) 4小时内上机测定，或各管中加入1%多聚甲醛0.5ml，充分混匀，2～8℃保存，24小时内上机测定。
4.流式细胞仪测定
( 1)在FSC/SSC散点图获取10 000个血小板。
( 2)分别在CD41直方图和CD61直方图中分析CD41和CD61表达率和荧光强度;或在CD41/CD61散点图中分析CD41和CD61表达率。
5.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
健康人CD41和CD61均为高表达，GT患者的CD41和CD61均有不同程度的减少和缺失。
【临床意义】
血小板表面膜糖蛋白GPⅡb和GP Ⅲa的表达可以帮助诊断GT及计数血小板。血小板无力症( GT)患者其血小板膜糖蛋白GPⅡb和GPⅢa出现表达缺失甚至产生质的异常，致使血小板在二磷酸腺苷( adenosine diphosphate，ADP)、胶原和凝血酶等刺激下也不能聚集，从而出现止血功能障碍。
【注意事项】
1.建议使用健康人标本作为阳性对照。
2.建议采用富含血小板血浆 尽管富含血小板血浆及全血标本均可进行GPⅡb和GPⅢa测定，但鉴于GT 时GPⅡb和GPⅢa可能缺乏，不适合CD41/SSC或CD61/SSC设门方案，而FSC/SSC设门方案不能准确区分红细胞和血小板，因此，不推荐首选全血标本。
(二) GPⅠb和GPⅨ测定 【原理】
GPⅠb ( CD42a)和GPⅨ( CD42b)是分布于血小板膜表面的糖蛋白，采用荧光素标记的抗GPⅠb抗体和抗GPⅨ抗体，通过流式细胞仪分析GP Ⅰb和GPⅨ的表达情况，可以帮助诊断巨大血小板综合征( Bernard-Soulier syndrome，BSS)。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的抗CD42a抗体、抗CD42b抗体及其同型对照。
2. pH 7.4的PBS。
3.荧光标准微球。
4.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
5.蒸馏水。
6.1%多聚甲醛。
7.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
枸橼酸钠抗凝静脉血3ml。
2.富含血小板血浆制备
抗凝静脉血在200g下离心5分钟，取上层血浆，PBS洗涤，取100μl含有1×10 6个血小板的细胞悬液加入试管中。
3.细胞膜免疫荧光染色
( 1)在测试管中加入适量(如20μl)的CD42a 和(或) CD42b抗体。
( 2)在对照管中分别加入适量(如20μl)的同型对照。
( 3)在测试管和对照管中各加入富含血小板血浆100μl。
( 4)轻轻混匀，室温暗处孵育15～20分钟。
( 5) 4小时内上机测定，或各管中加入1%多聚甲醛0.5ml，充分混匀，2～8℃保存，24小时内上机测定。
4.流式细胞仪测定
( 1)在FSC/SSC散点图获取10 000个血小板。
( 2)分别在CD42a直方图和CD42b直方图中分析CD42a和CD42b表达率;或在CD42a/CD42b散点图中分析CD42a和CD42b表达率。
5.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
健康人GPⅠb和GPⅨ均为高表达，BSS患者的GPⅠb和GPⅨ均有不同程度的减少和缺失。
【临床意义】
血小板表面膜糖蛋白GPⅠb和GPⅨ的表达缺失可以帮助诊断BSS。BSS发生时，血小板膜糖蛋白GPⅠb和GPⅨ出现缺失，使血小板黏附于内皮下组织发生功能缺陷，不能结合vWF，瑞斯托霉素也不能使血小板聚集，从而出现止血功能障碍。
【注意事项】
1.建议使用健康人标本作为阳性对照。
2.建议采用富含血小板血浆 尽管富含血小板血浆及全血标本均可进行GPⅠb和GPⅨ测定，但鉴于BSS 时GPⅠb和GPⅨ可能缺乏，不适合CD42a/SSC或CD42b/SSC设门方案，而FSC/SSC设门方案不能准确区分红细胞和血小板，因此，不推荐首选全血标本。
(三) GPⅡb/Ⅲa复合蛋白和GMP140测定 【原理】
GPⅡb和GPⅢa在静息血小板膜上以异二聚体复合物形式存在，当血小板活化时，GPⅡb/ Ⅲa复合物结构发生变化，并与纤维蛋白原结合。P-选择素( GMP140，CD62P)存在于静息血小板胞质α颗粒内，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表达CD62P，其出现要晚于活化的GPⅡb/Ⅲa复合物。通过流式细胞术多色分析法，结合荧光素标记的单克隆抗体，即可检测血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物和GMP140的表达情况，从而反映血小板活化状态。识别活化的GPⅡb/Ⅲa复合物和GMP140抗原的标志分别为PAC-1和抗CD62P抗体。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的抗CD41/CD61复合物抗体(推荐IgM型)。
2.荧光素标记的抗CD62P抗体。
3.荧光素标记的抗CD61抗体。
4. CD41/CD61复合物阻断剂，用于阴性对照(可选择)，制备方法参考说明书和浓度依据实验需求。
5. ADP或其他血小板激活剂，用于激活血小板(可选择)，制备方法参考说明书和浓度依据实验需求。
6. pH 7.4的PBS。
7.荧光标准微球。
8.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
9.蒸馏水。
10.多聚甲醛1%。
11.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
采用大号针头抽取静脉血，第二管使用枸橼酸钠抗凝管( 1∶9抗凝)抽取静脉血3ml，采集后在10分钟内尽快处理，完成血小板激活和染色步骤。
2.血小板激活
在流式细胞仪专用试管中加入适量ADP或其他血小板激活剂，再按比例加入适量全血，轻轻摇匀，室温孵育5分钟，即可进行免疫荧光染色。
3.采用全血法细胞膜免疫荧光染色
( 1)在测试管中分别加入适量(如20μl)的CD61、CD41/CD61复合物抗体及CD62P。
( 2)在对照管中分别加入适量(如20μl)的同型对照、CD61、CD41/CD61复合物抗体及其阻断剂。
( 3)分别在测试管和对照管中加入未激活或激活的血标本5μl。
( 4)轻轻混匀，室温避光孵育15～20分钟。
( 5)各管中加入预冷( 2～8℃)的1%多聚甲醛1ml，充分混匀，2～8℃避光放置30分钟。
( 6) 24小时内上机测定。
4.流式细胞仪测定
( 1)在CD61/SSC散点图中设定单一血小板群( CD61高荧光强度，低SSC)和黏附在血细胞上的血小板群( CD61高荧光强度，高SSC)，排除血小板碎片群( CD61高荧光强度，极低SSC)。
( 2)获取10 000个CD61阳性的血小板。
( 3)进一步在CD41/CD61复合物/CD62P散点图中分析CD41/CD61复合物和CD62P的表达率。
5.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
正常机体血小板GPⅡb/Ⅲa复合物和GMP140不表达，GPⅡb/Ⅲa复合物和GMP140升高提示血小板活化。
【临床意义】
用于判断血小板活化状态。当机体由于血栓性疾病、血栓前状态及心肺手术等疾病引起血小板活化时，血小板表面GPⅡb/Ⅲa复合物和GMP140升高。
【注意事项】
1.首选枸橼酸钠抗凝血; EDTA会影响血小板聚集，肝素易激活血小板。
2.避免体外血小板活化是本实验的关键
( 1)需用大号针头采血，首先抽取的2ml静脉血不用。
( 2)尽量避免标本在转运和操作过程中受到物理振动。
( 3)离心速度不宜过大。
( 4)取血后10分钟内完成染色和固定。
( 5)试管壁上不能有残留血，以免未染色血样影响试验结果。
( 6)尽早固定可降低血小板的自发活化。
( 7)不建议采用FSC/SSC设门，避免红细胞对血小板的干扰。
( 8)除同型对照和使用CD41/CD61复合物阻断剂的阴性对照外，建议采用未受激活的正常标本做阴性对照，用于监控在操作过程中是否存在体外血小板激活;同时采用受激活的正常标本做阳性对照。
(四)血小板相关免疫球蛋白测定 【原理】
当机体内出现抗血小板自身抗体时，血小板抗原会与这些血小板相关免疫球蛋白( platelet associated immunoglobulin，PAIg)相结合，采用荧光素标记的抗IgG、抗IgA、抗IgM，通过流式细胞术可以检测与血小板抗原结合的PAIgG、PAIgA及PAIgM。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的羊抗人IgG和(或) IgA和(或) IgM。
2.荧光素标记的羊抗鼠IgG和(或) IgA和(或) IgM，用作同型对照。
3. pH 7.4的PBS。
4.荧光标准微球。
5.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
6.蒸馏水。
7.多聚甲醛1%。
8.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
抽取EDTA或枸橼酸钠抗凝( 1∶9抗凝)的静脉血3ml。
2.富含血小板血浆制备
抗凝静脉血在200g下离心5分钟，取上层血浆，PBS洗涤，计数，1×10 6个血小板/100μl。
3.细胞膜免疫荧光染色
( 1)在测试管中加入适量(根据操作说明书)的荧光素标记的羊抗人IgG和(或) IgA和(或) IgM。
( 2)在对照管中分别加入适量(根据操作说明书)的荧光素标记的羊抗鼠IgG和(或) IgA和(或) IgM同型对照。
( 3)分别在测试管和对照管中加入富含血小板血浆100μl。
( 4)轻轻混匀，在室温下避光温育30分钟，洗涤2次，以PBS悬浮。
( 5) 4小时内上机测定，或各管中加入1%多聚甲醛0.5ml，充分混匀，2～8℃保存，24小时内上机测定。
4.流式细胞仪测定
( 1)在FSC/SSC散点图获取10 000个血小板。
( 2)分别在IgG或IgA或IgM直方图分析羊抗人IgG或IgA或IgM阳性率和荧光强度及羊抗鼠IgG或IgA或IgM阳性率和荧光强度。
5.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
PAIgG% ( PAIgA%或PAIgM%) =羊抗人IgG ( IgA 或IgM)阳性率－羊抗鼠IgG ( IgA或IgM)阳性率。
PAIgG ( PAIgA或PAIgM)荧光强度=羊抗人IgG ( IgA或IgM)荧光强度/羊抗鼠IgG ( IgA或IgM)荧光强度。
PAIgG、PAIgA及PAIgM常为多克隆抗体，因存在非特异性结合，在健康人中易可检出阳性，但阳性率不高，通常不超过10%，故每个实验室根据所采用的抗体不同，建立各自实验室的参考范围。
【临床意义】
血小板自身抗体是诊断特发性血小板减少性紫癜( idiopathic thrombocytopenia purpura，ITP)的重要指标，ITP患者的PAIgG和(或) PAIgA 和(或) PAIgM明显高于健康人。PAIg升高也见于部分系统性红斑狼疮( systemic lupus erythematosus，SLE)等免疫系统疾病及少数非免疫性血小板减少者。
【注意事项】
1.目前临床上尚无简单特异的方法检测血小板自身抗体，同常规ELISA方法比较，流式细胞术具有灵敏度高、重复性好、操作简便、需血量少等特点，适用于血小板明显减少的患者。但基于多克隆抗体假阳性较高，除同型对照外，建议设置阳性对照和阴性对照。
2.以含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性对照;以不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性对照。
3.流式细胞术检测PAIg的灵敏度高但特异性差，如能结合阳性率低但特异性高的血小板抗原单克隆抗体固相化法或血小板相关IgG特性试验等，可以提高PAIg检测的敏感度与特异性，从而进一步提高ITP的实验室诊断能力。
六、白细胞分类计数
【测定原理】
根据外周血白细胞分类细胞，如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及未成熟细胞表面抗原表达标志的不同和(或)荧光强度不同，采用适当的荧光素标记特异性单克隆抗体与白细胞反应，通过流式细胞仪测定，可以得到相应细胞群的阳性百分比。通常采用CD2标记T细胞和NK细胞; CD19标记B细胞; CD16标记中性粒细胞、细胞毒性T细胞、促炎性单核细胞; CD36标记单核细胞; CD294标记嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及活化T细胞; CD45用于标记所有白细胞。
【试剂与仪器】
1.荧光素标记的抗CD45、抗CD2、抗CD19、抗CD16、抗CD36、抗CD294等多种抗体的组合试剂。
2.红细胞裂解液。
3. pH 7.4的PBS。
4.荧光标准微球。
5.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
6.蒸馏水。
7.多聚甲醛1%。
8.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
采用EDTA抗凝静脉血2ml。
2.细胞膜免疫荧光染色
参考操作说明书。
3.流式细胞仪测定
参考操作说明书，以下设门和数据获取流程供参考(图1-6-3)。
图1-6-3 流式细胞术分类计数外周血白细胞的设门流程示意图
注: LY. B: B淋巴细胞; NE:中性粒细胞; MO:单核细胞; Eo:嗜酸性粒细胞，IG:未成熟粒细胞，LY. T＆NK:淋巴＆自然杀伤细胞; BA:嗜碱性粒细胞
( 1)首先用CD45/SSC作图( a)，用以确定细胞计数区( StopCount区)。
( 2)用CD19/SSC作图( b)，分出CD19阳性区( A门)和CD19阴性区( B门)。
( 3)在A门基础上用CD45/SSC作图( c)，分出B淋巴细胞( LY. B区)和原始B淋巴细胞( R2 门)。
( 4)在B门基础上用CD45/CD36作图( d)，分出CD45阴性区( C门)和CD45阳性区( D门)。
( 5)基于D门用CD16/SSC作图( e)，分出中性粒细胞( NE)和非中性粒细胞区( E门)。
( 6)基于E门用CD36/CD2 + CRTH2-作图( f)，分出单核细胞( MO) ( G门)和非单核细胞区( F 门)。
( 7)基于G门用CD16/SSC作图( g)，分出促炎性单核细胞( R6门)和炎性单核细胞( R7门)。
( 8)基于F门用CD16/SSC作图( h)，分出嗜酸性粒细胞及未成熟粒细胞区( Eo＆IG) ( H门) 和SS信号弱的细胞区( I门)。
( 9)基于H门用CD45/CD16作图( i)，分出嗜酸性粒细胞( EO)和未成熟粒细胞( IG)。
( 10)基于I门用CD45/SSC作图( j)，用以确定T淋巴细胞及NK细胞区( Lymph. T＆NK) ( J门) 和CD45阴性细胞区( K门)。
( 11)基于J门用CD16/SSC作图( k)，分出颗粒型T淋巴细胞及NK细胞( R4门)和非毒性T淋巴细胞及NK细胞( R5门)。
( 12)基于K门用CD45/CD2 + CRTH2作图( l)，分出原始非T非B淋巴细胞( R3门)和CD2 + CRTH2阳性细胞区( L门)。
( 13)基于L门用CD45/SSC作图( m)，分出嗜碱性粒细胞( BA区)和原始T淋巴细胞( R1门)。
4.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
结合上述组合荧光抗体的多色分析及逻辑设门方案，可以计数中性粒细胞、淋巴细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞+ NK细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、未成熟粒细胞、原始细胞，以及细胞毒性T淋巴细胞+ NK细胞、非细胞毒性T淋巴细胞、CD16阴性单核细胞(非炎性单核细胞)、CD16阳性单核细胞(促炎性单核细胞)、原始T淋巴细胞、原始B淋巴细胞、原始非T非B淋巴细胞等细胞的百分率。
【临床意义】
1.采用流式细胞术进行白细胞分类计数，能对血细胞分析仪出现的报警及异常结果进行确认，尤其是WBC相关异常信息和结果，从而降低血常规显微镜法的复检率。
2.采用流式细胞术进行白细胞分类，可以鉴定和计数未成熟粒细胞、原始细胞及异常淋巴细胞等细胞类型，对血液恶性肿瘤及相关疾病的诊断、鉴别诊断及预后监测具有一定的指导和提示作用。
【注意事项】
1.获取细胞数至少在20 000个白细胞及以上，以保证嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞等百分率相对较低或极低的细胞得到可靠的计数。
2.通过多重逻辑设门进行白细胞分类的操作流程相对烦琐，不能完全依赖自动化软件的分析，必要时需要进行人工微调。
七、网织红细胞计数
【原理】
网织红细胞含有的少量RNA，是成熟红细胞的前体细胞。采用某种荧光染料(如噻唑橙)与细胞内RNA结合，通过流式细胞术检测被染色的网织红细胞中的荧光强度，分析得到网织红细胞数量及成熟程度。网织红细胞越幼稚，细胞内RNA含量就越多，染料与RNA结合的越多，流式细胞术检测到的荧光就越强;反之亦然。
【试剂与仪器】
1.荧光染料噻唑橙。
2. pH 7.4的PBS。
3.荧光标准微球。
4.流式细胞仪配套试剂(如鞘液、清洗液)。
5.蒸馏水。
6.流式细胞仪。
【操作】 1.标本采集
采用EDTA抗凝静脉血2ml。
2.采用全血法细胞膜免疫荧光染色
①在测试管和对照管中分别加入全血标本5μl，并用PBS稀释至50μl;②在测试管内加入适量(按照操作说明书)的荧光染料噻唑橙;③轻轻混匀，室温避光孵育20～30分钟;④4小时内上机测定。
3.流式细胞仪测定
①在FSC/SSC散点图中设定红细胞群;②获取10 000个红细胞;③进一步在FITC散点图中分析噻唑橙阳性的网织红细胞百分率( %)和荧光强度。
4.其余
参考“血液恶性肿瘤免疫表型分析”操作部分。
【结果判定】
1.各实验室需建立各自的网织红细胞计数的参考范围。
2.网织红细胞绝对数量需借助血细胞分析平台计数RBC，网织红细胞绝对数量(×10 12/L) =网织红细胞%×RBC计数。
【临床意义】
网织红细胞计数可用于帮助诊断贫血及评估红细胞生成活性。溶血性贫血或急性失血时，骨髓造血代偿性增强，大量网织红细胞进入血液循环，可使网织红细胞计数升高。骨髓造血功能低下时，网织红细胞计数减少，低于15×10 9/L时，可帮助再生障碍性贫血。流式细胞术不但能计数网织红细胞，还能通过荧光强度评估网织红细胞成熟程度，用于评价贫血治疗前后、骨髓移植和肾移植前后红细胞的生成活性。但多功能流式细胞仪提供的评估网织红细胞成熟程度的指标尚需标准化。
【注意事项】
1.因采用荧光染料标记网织红细胞，无法设置同型对照。
2.采用待测标本的红细胞不进行任何染色直接测定作为阴性对照，以观察待测标本的自发荧光。
3.采用已知健康的标本与待测标本同步处理和检测，作为正常对照。