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第一节 血栓与止血检验标本的采集与处理
血栓与止血检验的标本采集以及前处理直接影响实验结果的准确性,因此,要求所有步骤均应规范操作(相关检测项目可参照卫生行业标准WS/T 359—2011《血浆凝固实验血液标本的采集及处理指南》的要求)。
一、标本的采集
(一)采血前的准备工作
采血时,首先应该确认患者姓名,并且将姓名和编号写在贮血容器上。安慰患者,努力减轻患者的恐惧心理。尽可能地保证每次采血都在同样的条件下进行,即患者处于休息状态,并且在早餐前采血。
服用某些药物或某些生理状况(如怀孕、情绪激动或剧烈运动)会对一些凝血试验结果造成影响。阿司匹林、双嘧达莫等双联抗栓药物能抑制血小板聚集;口服避孕药、雌激素会使血小板黏附功能、聚集功能和纤维蛋白原,凝血酶原及凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ的活性明显增高;剧烈运动或输注肾上腺素时,因子Ⅷ活性快速上升;口服香豆素类抗凝药物,可以使维生素K依赖的凝血因子(因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)和抗凝蛋白(蛋白C、蛋白S)等活性下降。故一般在进行此类检验时,应停用有关药物2周,因故不能停药者,必须注明用药状态。
(二)采血的技术要点 1.患者要求
取血时患者应松弛,环境温暖,防止静脉挛缩,止血带的压力应尽可能小,压力大及束缚时间长可造成局部血液的浓缩和内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活物( tissue plasminogen activator,t-PA),后者将引起纤溶活性增加。
2.部位
除了出血时间( BT)及对新生儿的某些检测外,绝大多数凝血检测均应使用静脉血。
3.采血人员
应技术熟练,“一针见血”,以防止组织损伤和外源性凝血因子进入针管。反复静脉穿刺可以导致血小板活化,致使血小板计数( PLT)假性减少;储存时间影响PLT标本应保存于室温,低温可激活血小板,储存时间过久可导致PLT偏低。因此,标本应置室温,2小时内完成检测。
4.试管
市售的真空采血管,由于具有采血便捷、定量且有多种抗凝剂可供选择,有的管壁已进行了硅化等优点,因此非常适合于血栓与止血的检验。取血后管内剩余空间应不小于所抽血液体积的15%。因为采取的样品常含小凝血块及污染的组织液,有时尚可混有经此途径给予的药物,如肝素反流在样品中,导致凝血时间不应有的延长。故从输液管取血的做法不可取。
5.标本放置时间
尽量缩短。这对某些检测很重要,如因子Ⅷ最不稳定,若无法立即检测,可将标本置于-80℃冰箱中。纤维蛋白肽A ( FPA)和β-血小板球蛋白(β-TG)在稍有组织损伤或标本放置时间较长时即可导致结果改变。血小板功能检测,标本应该储存于18~24℃,禁止存放于冰箱中。
6.其他
取血时,拉针栓的速度要慢且均匀,使血液平稳地进入注射器,防止气泡的产生。如果抽血过慢或不太顺利,可能激活凝血系统,试验结果将会显示凝血因子活性增高,血小板数假性降低等异常结果。一旦取样完毕,立即与抗凝剂在试管内充分混合。
二、标本的保存
标本保存的温度与时间,可影响凝血因子的促凝活性,因此严格的标本保存措施是分析前质控的重要内容。所采血样原则上应立即检测,若无法满足,试管口应加塞,否则将会因CO 2的散失而导致pH的改变。如果不能在4小时内完成所有试验,应将血浆标本低温保存(-70~-20℃),试验前将血浆于37℃下快速融化。血小板聚集试验应在采血后2小时内完成。
如需要富含血小板的血浆( PRP),可以室温下每分钟800~1000转离心10分钟;缺乏血小板的血浆( PPP)可用于大多数的凝血试验,制备必须在大于或等于每分钟3000转条件下离心15分钟。
1.抗凝剂
因子Ⅴ和因子Ⅷ在枸橼酸盐溶液中稳定性比在草酸盐溶液中好,用于凝血筛查试验、凝血因子检测或血小板聚集功能测定时,抗凝剂必须采用枸橼酸钠。另外,采集于枸橼酸盐溶液中的标本对肝素敏感性高于用草酸盐溶液抗凝时,这对于应用肝素时活化部分凝血活酶时间( APTT)监测十分重要。
枸橼酸钠浓度推荐是109mmol/L ( 3.2%) Na 3C 6H 5O 7·2H 2O或 0.129mol/L ( 3.8%)的Na 3C 6H 5O 7·5H 2O溶液。抗凝剂与血液比例要求是1∶9。但对于血细胞比容明显异常的患者,抗凝剂与全血的比例应进行调整,或计算抗凝剂的体积( ml) = 1.85×10 -3×血量×( 100-血细胞比容)。有研究表明,血细胞比容45%的患者,以抗凝剂与血液比例分别为1∶9和1∶5采血,其凝血酶时间( PT)的结果分别为11.7秒和18.7秒,存在显著差异。
若用于血小板颗粒释放产物β-TG、血小板第4因子( PF 4)或P-选择素测定时,由于要尽量避免血小板的体外活化而造成的结果变异,抗凝剂以选择EDTA-Na 2为宜,同时抗凝剂中要加入茶碱、吲哚美辛(消炎痛)等,以避免血小板活化,抗凝剂与血浆的比例一般情况下也是1∶9。
2.检测试剂
各种凝血活酶试剂对因子Ⅶ敏感性各不相同,导致一步法PT试验的结果不尽相同;同样活化部分凝血活酶试剂也存在这些问题。所以在选择试剂时应掌握下列原则:
( 1)根据试剂对所检测物质不同的敏感性,选择最适的试剂:以APTT试剂为例,通常以磷脂作为接触表面,用白陶土、硅藻土或鞣花酸作为激活剂。但上述激活剂对肝素、因子Ⅷ和因子Ⅸ及狼疮抗凝物质缺乏的敏感性各不相同,在检测中就应根据不同的检测对象选择合理的激活剂。
( 2)按照仪器性能和厂商指导选用匹配的试剂:某些活化部分凝血活酶试剂不适用于部分仪器,如混浊的或含颗粒的活化部分凝血活酶试剂就不能用在光学法判断终点的仪器上。
( 3)商品试剂使用严格遵循产品说明:用于口服抗凝剂监测的PT试剂必须按WHO的要求进行标化,提供国际敏感度指数( ISI),结果以国际标准化比值( INR)报告。