血浆蛋白质种类繁多，怎样分类是复杂的问题，可以从不同角度对其进行归纳分类。如将血浆蛋白质简单分为清蛋白和球蛋白两大类，按化学结构分为单纯蛋白质和结合蛋白，根据功能进行分类等。至今较实用的仍是通过电泳获得的条带，对血浆蛋白质概貌谱分类。蛋白电泳( protein electrophoresis)指利用溶液中带电粒子在直流电场作用下向所带电荷相反电极方向移动，所带电荷越大、直径越小或越接近球形则移动越快，从而对蛋白不同组分进行分离鉴定的技术。

两性电解质蛋白质在一定的pH溶液中所带正、负电荷数恰好相等，即分子的净电荷等于零，此时该蛋白质在电场中不会移动，溶液的这一pH，称为该蛋白质的等电点。若溶液pH＜pI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动;若溶液pH＞pI，则蛋白质带负电荷，就向正极移动。不同蛋白质的迁移率主要受所带电荷大小、分子量和形状影响。按有无支持介质可将电泳分为自由电泳和支持物电泳，后者较多应用。血清蛋白电泳多用表面带电荷较少的惰性支持介质，如滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂糖凝胶，该类介质虽然分辨率较低，但较少电渗。滤纸吸附效应较强，易使蛋白区带形成小的拖尾，且滤纸不透明不能用光密度计扫描，血清蛋白纸电泳已经淘汰。醋酸纤维素膜对蛋白质吸附小故拖尾现象轻，区带界限清晰，通常较短分离时间即可将血清蛋白分为5条清晰区带，并且能透明，可用光密度计扫描，染色后则可长期保存，但醋酸纤维素膜吸水性差，电阻较大，电泳时产热明显，导致膜中水分易蒸发及蛋白质变性破坏，影响电泳结果，需注意选择合适电压。琼脂是一种多糖，经处理去除其中的果胶，即为琼脂糖，琼脂糖链受氢键及其他力的作用而互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶，具备分子筛功效，故分辨率好，可将血清蛋白分离出8～11条区带，而且琼脂糖中 较少，电渗影响弱，使分离效果显著提高，血清琼脂糖凝胶电泳是临床常用的血清蛋白电泳检测技术。毛细管电泳或称高效毛细管电泳是指以毛细管为分离柱，由于毛细管置于冷却系统中有效地冷却降温，故可加以直流高压作为驱动力，使样品在高压电场中快速泳动，达到高效分离的一类新型电泳技术，具有高效、快速、高分辨率等优点。

其他支持介质如聚丙烯酰胺凝胶，因不同浓度和交联度可形成不同孔径的三维网状结构，兼有电泳支持体及分子筛的功能，提高了分辨率，在适当条件下可分出30多条区带，但未在临床常规使用。下面将介绍血清蛋白醋酸纤维素膜电泳方法、琼脂糖凝胶电泳方法和毛细管区带电泳方法。

血清蛋白质等电点( pI)大都＜7.3，因此，在pH 8.6缓冲液中，几乎所有血清蛋白质均为带负电荷的质点，在电场中向正极泳动。由于血清中各种蛋白质pI不同，所带电荷量有差异，加之相对分子质量不同，形状有差异，故在同一电场中迁移率不同，经过一定时间后，得以分离形成可分辨的区带。由于CAM对蛋白质吸附小，区带清晰，分离时间短，并且对染料不吸附，无背景干扰，染色后可较长期保存，亦可透明化用光密度计直接扫描，为血清蛋白电泳最常使用的支持介质，血清蛋白CAM电泳通常可获得5条清晰区带。

电压0～600V、电流0～300mA的晶体管整流稳压稳流直流电源。

选用适合CAM电泳的铂丝电极的水平电泳槽，电泳槽的膜面空间与CAM面积应为5cm ³/cm ²。

微量吸管( 10μl，分度0.5μl)或专用电泳血清加样器。

选用质量可靠的产品。

醋酸纤维素薄膜2cm×8cm规格，质地均匀、孔细、吸水性高、染料吸附少，分离效果好的产品。

1.巴比妥缓冲液( pH 8.6，离子强度0.06)准确称取巴比妥2.21g，巴比妥钠12.36g于500ml蒸馏水中加热溶解，待冷至室温后，用蒸馏水定容至1L。

2.染色液

( 1)丽春红S染色液:称取0.4g丽春红S及6.0g三氯醋酸，用蒸馏水溶解，并定容至100ml。

( 2)氨基黑10B染色液:称取0.1g氨基黑10B，溶于20ml无水乙醇中，再加冰醋酸5ml，甘油0.5ml，混匀。另取2.5g磺基水杨酸，溶于74.5ml蒸馏水中。再将二液混合摇匀。

3.漂洗液

( 1) 3% ( V/V)醋酸溶液:适用于丽春红S染色漂洗。

( 2)甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。

4.洗脱液　0.1mol/L氢氧化钠溶液，适用于丽春红S染色洗脱; 0.4mol/L氢氧化钠溶液，适用于氨基黑10B染色洗脱。

5.透明液　称取21g柠檬酸( C ₆H ₅O ₇Na ₃· 2H ₂O)和150g N-甲基-2-吡咯烷酮，以蒸馏水溶解并定容至500ml。如不需保存亦可用十氢萘或液状石蜡为透明液。

1.将电泳槽置于水平平台上，电泳槽两侧内加入等量巴比妥缓冲液，使两侧槽内的缓冲液在同一水平面，液面与支架距离约2～2.5cm。

2.取CAM ( 2cm×8cm)一张，在毛面的一端(负极侧) 1.5cm处，用铅笔轻画一横线作点样标记，编号后，将CAM毛面向下漂浮于盛有巴比妥缓冲液的平皿中，待其自然浸润下沉并充分浸透后(约20分钟)取出。夹于洁净滤纸中间，吸去多余的缓冲液。

3.将CAM毛面向上，画线端朝向负极贴于电泳槽的支架上轻轻拉直，用微量吸管吸取样本血清在横线处沿横线加3～5μl。样品应与膜的边缘保持一定距离，以免电泳图谱中蛋白区带变形。待血清渗入膜后，反转CAM，使光面朝上，画线端朝向负极平直地贴于电泳槽支架上，用双层滤纸或4层纱布将膜的两端与缓冲液连通(桥联)，平衡5分钟。

4.接通电源　将电泳槽与电泳仪的正、负极连接，注意CAM上画线端一定接负极。调节电压为90～150V、电流0.4～0.6mA/cm膜长，夏季通电45分钟，冬季通电60分钟，待电泳区带展开约25～35mm，即可关闭电源结束电泳。上述电泳参数设置，不同电泳仪和室温要求不同，应摸索建立。

5.染色　取下CAM直接浸于丽春红S或氨基黑10B染色液中，轻轻晃动染色5～10分钟(以清蛋白带染透为止)。薄膜条较多时，需使用较大的器具盛染液，避免薄膜条紧贴或重叠，影响染色效果。

6.漂洗　准备3～4个漂洗皿，装入漂洗液。从染色液中取出染好色的CAM并尽量沥去染色液，依次投入漂洗皿漂洗，直至背景无色为止。

7.定量　包括洗脱后比色定量及光密度扫描法2种定量方法。

( 1)洗脱比色定量法:将漂洗净的膜吸干，剪下各染色蛋白区带，并在膜的无蛋白质区带部分，剪取与清蛋白区带同宽度膜条，作为空白对照，分别放入已编号的试管内洗脱。氨基黑10B染色用0.4mol/ L氢氧化钠洗脱，清蛋白管内加6ml (计算时吸光度乘以2)，其余各加3ml，置37℃水箱20分钟，不时振摇，使染料完全浸出至洗脱液中。用分光光度计在620nm处以空白管液调零，读取各管吸光度。丽春红S染色，浸出液用0.1mol/L氢氧化钠，加入量同上。10分钟后，向清蛋白管内加40% ( V/V)醋酸0.6ml (计算时吸光度乘以2)，其余各加0.3ml，以中和部分氢氧化钠使色泽加深。必要时离心沉淀，取上清液，用分光光度计520nm处以空白管液调零，读取各管吸光度。

( 2)光密度扫描法

1)透明:对需保存CAM，吸去膜上的漂洗液(防止透明液被稀释影响透明效果)，将薄膜浸入N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸透明液中2～3分钟(可适当延长一些时间)，取出以滚动方式平贴于洁净无划痕的载物玻璃片(切勿产生气泡)，将此玻璃片竖立片刻，尽量沥去透明液后，置已恒温至90～100℃烘箱内烘烤10～15分钟，取出冷至室温。用此法透明的各条蛋白区带鲜明，薄膜平整，可供直接扫描和保存。对不保存的CAM，可将漂洗过的薄膜烘干后，用十氢萘或液状石蜡浸透，夹于两块优质薄玻片间供扫描用。此法透明的薄膜不能久藏，且易发生皱褶。

2)扫描定量:将已透明的薄膜放入全自动光密度计内，进行扫描分析。

通常血清蛋白CAM电泳可获得从正极端起依次为白蛋白、α ₁-球蛋白、α ₂-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白的5条区带。扫描法时，全自动光密度计可自动报告各组分蛋白占总蛋白的百分比。洗脱比色定量法可按下式计算:

式中，A _x表示各区带蛋白测定的吸光度; A _T表示各区带蛋白吸光度总和。

根据同时测定的血清总蛋白浓度，可按下式计算出各区带蛋白的浓度:

各区带蛋白( g/L) =各区带蛋白( %)×血清总蛋白( g/L)。

用百分率报告各组分的相对量时，任何组分的增减，即便其他组分绝对含量虽然正常，也会出现相应的减增，所以最好同时报告相对比值和绝对浓度。由于各实验室采用的电泳条件不同，再加之不同地区人群间可能存在生物学变异，参考区间存在差异，故各实验室应建立自己测定体系的参考区间，表2-1-4列出的参考区间引自《全国临床检验操作规程》(第3版)，仅供参考。

使用光密度计扫描定量一般用丽春红S染色，因其可与各组分蛋白浓度基本呈正比例结合，结果较准确。用洗脱比色法定量时，用丽春红S或氨基黑10B均可，但选用氨基黑10B时，因其对白蛋白亲和力更高，特别是白蛋白浓度高时，可因白蛋白染色过深，导致白蛋白结果偏高而球蛋白偏低;或者白蛋白区带染色不透，出现小空泡甚至蛋白膜脱落在染色液中，严重影响结果的准确性。因此血清总蛋白＞80g/L时，用氨基黑10B染色应将血清对半稀释再加样。

由于缓冲液的pH及离子强度对电泳结果影响大，除保证严格按规定配制外，每次电泳时应交换正负电极，以使电泳槽两侧缓冲液的正、负离子相互交换，维持缓冲液的pH和离子强度不至于发生较大改变。即便如此，因每次电泳的薄膜数量可能不等，所以缓冲液使用10次后仍应更换。

电泳槽缓冲液的液面要保持一定高度，过低可能会增加γ-球蛋白的电渗现象(向阴极移动)。同时电泳槽两侧的液面应保持同一水平面，否则，会通过薄膜产生虹吸现象，严重影响蛋白分子的迁移率。

加样不均匀、样品触及薄膜边缘、薄膜未完全浸透或温度过高致使膜局部干燥或水分蒸发、缓冲液变质;电泳时薄膜放置不正确，使电流方向不平行。

点样过多、电流过低、薄膜质量差等。

染色时间不足或染色液陈旧所致;若因蛋白含量高引起，可稀释血清或延长染色时间。一般以延长2分钟为宜，若时间过长，球蛋白百分比上升，A/G比值会下降。

烘箱温度未达到90℃以上就将膜放入、透明液陈旧和浸泡时间不足等。

玻片上有油脂，使薄膜部分脱开或贴膜时滚动不佳。

已有全自动电泳系统上市，电泳支持物为琼脂糖或CAM，可自动完成电泳、烘干、染色、漂洗，最后自动扫描光密度，打印出图形及定量报告。由于从电泳到光密度扫描均在电脑程序控制下自动完成，可有效减少操作误差。只要严格使用配套试剂及器材，严格按规定操作，重复性高。但这类仪器适用于标本量多的单位使用，若样本量少，经济上很不合算。

血清蛋白质等电点( pI)大都＜7.3，因此，在pH 8.6缓冲液中，几乎所有血清蛋白质均为带负电荷的质点，在电场中向正极泳动。由于血清中各种蛋白质pI不同，所带电荷量有差异，加之相对分子质量不同，形状有差异，故在同一电场中迁移率不同，经过一定时间后，得以分离形成可分辨的区带。使用琼脂糖凝胶的优点是电泳速度快，血清样品无需处理即可直接加样进行检测;琼脂糖凝胶兼具分子筛功效，分辨率好;电泳区带易染色，干燥后背景几乎无色，便于光密度扫描检测。

1.琼脂糖凝胶电泳仪　选用质量可靠的国产或进口仪器。

2.血清加样器　微量吸管( 10μl，分度0.5μl)或专用电泳加样器。

3.点样支架　选用质量可靠的产品或配套产品。

4.点样梳　选用质量可靠的产品或配套产品。

5.琼脂糖凝胶电泳专用滤纸。

6.全自动光密度计　选用质量可靠的产品。

购买合格的商品化试剂盒，以某仪器配套的试剂盒为例，包括:①琼脂糖凝胶胶片;②缓冲液;③点样梳;④薄滤纸;⑤染液;⑥脱色液;⑦湿盒。

按仪器操作和试剂说明书进行，该试剂在适用于该试剂盒的某型号自动化琼脂糖凝胶电泳仪上操作如下:

1.点样　点样梳每孔加血清10μl。点样完毕后，应让样品在梳齿内扩散5分钟。若不能立即电泳，需将点样梳梳齿向上置于湿盒内。

2.架设缓冲条　打开电泳舱盖并升起点样支架，取出两根缓冲条嵌于支架的正负两极。缓冲条的海绵部分应紧贴在电极铂金丝上。

3.铺设凝胶胶片。

4.取出胶片，正面向上　用薄滤纸轻轻覆盖琼脂糖凝胶表面，吸取多余的缓冲液，并迅速移走滤纸。

5.在电泳板框的下1/3处滴加约200μl蒸馏水。将胶片放置于电泳平台框标内，确定胶片背面无气泡，并轻轻放下点样支架。

6.上样　去除点样梳的外围支架，梳齿向下插入点样支架的相应位置。关闭电泳舱盖，进行电泳。

7.染色　放入染色液中约10分钟。

8.脱色　将染色完毕的胶片放入脱色液中。脱色至胶片背景恰好无色。

9.干燥　将脱色后的凝胶片置于冷风下吹干。

10.扫描电泳结果　将已透明的胶片放入全自动光密度计内，进行扫描分析。

通常血清蛋白琼脂糖电泳可获得从正极端起依次为白蛋白、α ₁-球蛋白、α ₂-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白的5条区带。扫描法时，全自动光密度计可自动报告各组分蛋白占血清总蛋白的百分比。

根据同时测定的血清总蛋白浓度，可按下式计算出各区带蛋白的浓度:

各区带蛋白( g/L) =各区带蛋白( %)×血清总蛋白( g/L)。

成人血清蛋白琼脂糖凝胶电泳参考区间:

白蛋白: 59.8%～72.4%

α ₁-球蛋白: 1.0%～3.2%

α ₂-球蛋白: 7.4%～12.6%

β-球蛋白: 7.5%～12.9%

γ-球蛋白: 8.0%～15.8%

以上参考区间引自试剂说明书。

电泳失败的判断及原因分析:

加样不均匀、样品触及胶片边缘、胶片未完全浸透或温度过高致使膜局部干燥或水分蒸发、缓冲液变质;电泳时胶片放置不正确，使电流方向不平行。

点样过多、电流过低、胶片质量差等。

染色时间不足或染色液陈旧所致;若因蛋白含量过高引起，可稀释血清或延长染色时间。一般以延长2分钟为宜，若时间过长，球蛋白百分比上升，A/G比值会下降。

洗脱液陈旧和浸泡时间不足等。

毛细管电泳的理论基础建立在电双层的概念之下。在与电解液接触的直立电极上加电压，带相反电荷的离子积聚在电极表面，电荷载体的这种布置即称为电双层。毛细管区带电泳是毛细管电泳7种经典分离方式之一，其原理是将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和，流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序，以不同的速度移动通过检测器而分离。但中性组分彼此不能分离。

选用质量可靠的国产或进口仪器。

微量吸管或专用电泳加样器。

选用质量可靠的产品或配套产品。

选用质量可靠的产品或配套产品。

选用质量可靠的产品或配套产品。

选用质量可靠的产品或配套产品。

按仪器操作和试剂说明书进行，该试剂在适用于该试剂盒的某型号毛细管电泳仪上操作如下:

采用8条毛细管通道并行运作，快速电泳分离的全自动、多任务处理的毛细管电泳系统。从连续进样到最后电泳结果传输全过程包括:标本识别、稀释、毛细管清洁、标本进样、电泳、检测、结果处理等全部自动完成，其中操作人员仅需分离血清上机，其余步骤均由仪器自动完成。

系统自动将毛细管电泳仪测定的6条区带百分比转换成5条区带的百分比(β ₁-球蛋白和β ₂-球蛋白百分比将合并为β-球蛋白百分比)。其余结果计算方式同血清蛋白琼脂糖电泳方法。

成人血清蛋白毛细管区带电泳参考区间:

白蛋白: 55.8%～66.1%

α ₁-球蛋白: 2.9%～4.9%

α ₂-球蛋白: 7.1%～11.8%

β-球蛋白: 8.4%～13.1%

β ₁-球蛋白: 4.7%～7.2%

β ₂-球蛋白: 3.2%～6.5%

γ-球蛋白: 11.1%～18.8%

以上参考区间引自试剂说明书。

血清蛋白电泳的原理是按不同蛋白的迁移率进行分离鉴定，每一区带都是电泳体系中具有相同或相近迁移率的蛋白质混合物，CAM电泳通常仅形成5条区带。而多数有较高诊断意义的蛋白质在血清中都是微量存在，其浓度改变一般不会对其所在区带产生明显影响。因此，仅表2-1-5中列出的疾病时，CAM电泳结果可出现较明显改变，有一定临床意义。